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Investigación sobre el cáncer
0 vistas • 3:34 min • April 30th, 2023
El peritoneo, o la membrana que recubre la cavidad abdominal, constituye células mesoteliales peritoneales sostenidas sobre una capa de tejido conectivo fibrovascular. Las células de cáncer de ovario metastásicos se adhieren a este revestimiento peritoneal y proliferan en crecimientos cancerosos.
Para modelar la metástasis del cáncer de ovario, comience tomando fibroblastos humanos en un tubo cónico y mézclelos con colágeno, una proteína de la matriz extracelular. Coloque la suspensión en una placa de cultivo. Incubar para facilitar la solidificación de la matriz de colágeno para incrustar los fibroblastos e imitar el tejido conectivo del peritoneo.
A continuación, agregue una suspensión de células mesoteliales sobre la capa de fibroblastos y colágeno. Incube la placa para permitir que las células mesoteliales se adhieran y formen una monocapa en la superficie de la capa de fibroblastos-colágeno. Este cultivo organotípico 3D ahora imita la composición y arquitectura de un revestimiento peritoneal in vivo.
Finalmente, siembre este cultivo organotípico con células de cáncer de ovario e incube durante el tiempo deseado. Las células de cáncer de ovario liberan ciertas moléculas de señalización que alteran la capa mesotelial, mejorando la adhesión e invasión de las células cancerosas, imitando las condiciones metastásicas in vivo.
Para liberar los fibroblastos normales del epiplón del cultivo, enjuague el matraz de cultivo con 10 mililitros de PBS seguidos de 3 mililitros de tripsina durante no más de 5 minutos. Cuando las células se hayan desprendido, neutralice la tripsina con al menos tres veces el volumen del medio de crecimiento completo y transfiera las células a un tubo cónico de 50 mililitros. Gire las células y vuelva a suspender el gránulo en 5 mililitros de medio de crecimiento completo. Luego, cuente las células y dilúyalas a un 2 a 4 veces 10 al tercer fibroblasto por cada 100 microlitros de concentración completa del medio de crecimiento.
A continuación, agregue 0.5 microgramos por 100 microlitros de colágeno I de cola de rata a las células y coloque 100 microlitros de células por pocillo en una placa negra y transparente de 96 pocillos. Luego, transfiera la placa a una incubadora de cultivo celular durante al menos 4 horas o hasta que las células se adhieran a la superficie de la placa. Mientras los fibroblastos normales del epiplón se asientan, separe el HPMC de sus matraces de cultivo y diluya estas células de 1 a 2 veces 10 hasta el cuarto HPMC por 50 microlitros de medio de crecimiento completo.
Luego, agregue 50 microlitros de HPMC por pocillo a los fibroblastos de epiplón normales adheridos y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular durante al menos 18 horas antes del uso experimental. Al día siguiente, siembre los cocultivos organotípicos 3D con células de cáncer de ovario que expresan GFP de un cultivo confluente del 80% al 90% en la dilución adecuada para el ensayo posterior deseado.