Aislamiento de células mesoteliales: una técnica para aislar células mesoteliales primarias de muestras de tejido de epiplón humano

Las células mesoteliales primarias humanas, o HPMC, recubren muchos órganos viscerales como el epiplón o la capa de tejido graso presente en la cavidad peritoneal.

Para aislar las células mesoteliales, comience sumergiendo una muestra de epiplón humano en un tampón adecuado para eliminar el exceso de glóbulos rojos o glóbulos rojos. A continuación, coloque el epiplón en un plato de vidrio y píquelo en trozos. Esto disocia el tejido, liberando HPMC junto con los glóbulos rojos contaminantes.

Transfiera las piezas a un tubo cónico y déjelas quietas durante el tiempo deseado. El tejido picado rico en grasa de baja densidad sube a la parte superior, mientras que los componentes celulares densos se asientan en la parte inferior. A continuación, aspire el líquido en la parte inferior, que contiene HPMC y glóbulos rojos, en un tubo nuevo.

Centrifugar para recolectar las células. Retire el sobrenadante que contiene tampón. Vuelva a suspender el gránulo en un medio de crecimiento mesotelial e incube durante el tiempo deseado. El medio facilita el crecimiento selectivo de HPMC sobre RBC.

Observe las células con un microscopio óptico para confirmar el crecimiento de células mesoteliales humanas de forma cúbica.

Tras la adquisición de una muestra quirúrgica de epiplón humano, sumerja inmediatamente la muestra en PBS a temperatura ambiente. Dentro de las 2 horas posteriores a la inmersión, transfiera el epiplón a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 20 mililitros de PBS fresco. Transfiera el lavado de PBS restante que contiene las células mesoteliales humanas primarias o HPMC y glóbulos rojos a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y gire las células hacia abajo.

Luego, vierta el contenido del tubo en una placa de cultivo estéril de 10 centímetros y use dos bisturíes para picar el tejido en trozos de 5 milímetros cúbicos. Para aislar las células mesoteliales humanas primarias o HPMC, transfiera las piezas de epiplón a un tubo cónico de 50 mililitros y espere 1 minuto para que las piezas sólidas floten hacia la parte superior. El HPMC se asentará en el fondo del tubo con los glóbulos rojos.

Use una pipeta para transferir el lavado PBS que contiene células mesoteliales y glóbulos rojos al tubo que contiene las células granuladas y centrifugar las células. Luego, agregue 20 mililitros de PBS fresco al epiplón y recolecte el HPMC y los glóbulos rojos que contienen PBS tres veces más, como se acaba de demostrar a las células granuladas originales.

Después del giro final, coloque las células en un matraz de 75 centímetros cuadrados en 15 mililitros de medio de crecimiento completo. Para aislar HPMC adicional de la muestra de epiplón, agite el tejido sólido restante en 20 mililitros de PBS a 200 RPM y 37 grados Celsius. Después de 10 minutos, deje reposar la muestra durante 1 minuto para permitir que el tejido sólido suba a la parte superior del tubo.

Luego, recoja el HPMC y los glóbulos rojos del fondo del tubo como se acaba de demostrar. Ahora, gire las células del lavado secundario y colóquelas en un matraz separado de 75 centímetros cuadrados en 15 mililitros de medio de crecimiento completo. Para aislar cualquier HPMC restante, agite el tejido durante otros 10 minutos, esta vez en una mezcla de PBS y 10 mililitros de tripsina-EDTA, y coloque estos HPMC y RBC en un matraz de 75 centímetros cuadrados.

Luego, incube los cultivos a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono en un ambiente humidificado. Alimentar las células sembradas con 15 mililitros de medio fresco de crecimiento completo los días 3 y 5 sin quitar el medio gastado. Las HPMC se pueden identificar por su forma cuboidal y su expresión de citoqueratina-8 y vimentina.