JoVE Encyclopedia of Experiments
Investigación sobre el cáncer
0 vistas • 4:34 min • April 30th, 2023
Durante la metástasis del cáncer de ovario, las células malignas se desprenden del sitio del tumor primario y comienzan a circular dentro de la cavidad peritoneal. Estas células pueden formar grupos o esferoides que se adhieren a la monocapa de células mesoteliales que recubre la cavidad peritoneal. A medida que el tumor crece, elimina las células mesoteliales subyacentes para facilitar la invasión.
Para modelar la depuración mesotelial, comience sembrando células mesoteliales que expresan proteína verde fluorescente o GFP en una placa de cultivo con fondo de vidrio recubierta de fibronectina. El recubrimiento de fibronectina proporciona una matriz que promueve la unión celular. Incube el plato para permitir que las células mesoteliales se extiendan y formen una monocapa.
A continuación, transfiera una suspensión de esferoides de células de cáncer de ovario que expresan proteína fluorescente roja a la monocapa mesotelial. Obtener imágenes del cultivo durante un período prolongado mediante microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo. Los esferoides fluorescentes rojos se asentarán y se unirán a la monocapa mesotelial fluorescente verde.
Las células cancerosas ejercen fuerza sobre las células mesoteliales, interrumpiendo las uniones celulares y alterando la integridad de la capa mesotelial. La fuerza también desplaza las células mesoteliales subyacentes, generando un agujero. Elija una configuración de filtro GFP adecuada para visualizar el agujero resultante como un espacio negro en la imagen. Mida el espacio para cuantificar el grado de depuración mesotelial.
Para comenzar este procedimiento, cubra previamente los pocillos de una placa MatTek con fondo de vidrio de 6 pocillos con fibronectina. Agregue 2 mililitros de solución de fibronectina / PBS a cada pocillo de la placa e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las células mesoteliales que expresan proteínas fluorescentes verdes, para formar una monocapa de células mesoteliales, se cultivan en medio base al 10%. Tripsinizar una placa de células mesoteliales y centrifugar en una centrífuga de mesa a 900 RPM durante tres minutos.
Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un medio base al 10%. Ajustar a la concentración deseada con un 10% de medio base. Cuando se complete la incubación de fibronectina de 30 minutos de la placa MatTek, lave los pocillos con 2 mililitros de PBS. Aspire el PBS y coloque una placa 6 veces 10 a la quinta celda mesotelial por pocillo en cada pocillo de la placa MatTek de 6 pocillos. Incube la placa MatTek en una incubadora de cultivo celular a 37 grados Celsius durante la noche para permitir que las células mesoteliales se adhieran a la placa y formen una monocapa.
Utilice una pipeta para recoger los esferoides de cáncer de ovario de la placa recubierta de poli-HEMA de 96 pocillos. Aspire el medio de un pocillo de la placa MatTek de 6 pocillos que contiene una monocapa de células mesoteliales. Lavar una vez con 2 mililitros de PBS. Agregue todos los esferoides de la placa de 96 pocillos a un pocillo del plato MatTek. Esto es aproximadamente tres veces el número de esferoides que se van a fotografiar para tener en cuenta los esferoides que aterrizan en la parte del plato que no se puede fotografiar.
Dado que queremos obtener imágenes de un solo esferoide por campo de visión, se debe evitar la agregación de los esferoides. Mueva el plato suavemente de lado a lado para distribuir los esferoides uniformemente a través de la monocapa antes de que se adhieran.
Coloque el plato MatTek en la platina de un microscopio de fluorescencia de campo amplio invertido capaz de realizar imágenes de lapso de tiempo durante al menos ocho horas. Utilice una platina motorizada para obtener imágenes de múltiples posiciones en el plato, con múltiples eventos de intercalación de esferoides, en un solo experimento. Los esferoides de células cancerosas de ovario se asentarán en el fondo del plato y se unirán a la monocapa de células mesoteliales. Recopile imágenes de GFP, RFP y fase de más de 20 interacciones esferoides/monocapa cada diez minutos durante ocho horas.