Ensayo de espín de agarosa: una técnica para incrustar organoides para el análisis histológico

cultivos de organoides 3D de células cancerosas recapitulan muchas características fisiopatológicas de los cánceres humanos. Por lo tanto, estos cultivos in vitro forman un excelente modelo para la investigación del cáncer.

Para procesar estos organoides, comience con un cultivo de organoides 3D preformados cultivados en una matriz de membrana basal adecuada. Agregue un medio de recuperación celular deseado e incube. El medio facilita la despolimerización del gel de matriz, liberando los organoides 3D en la solución.

Centrifuga esta mezcla para peletizar los organoides. El medio de recuperación que contiene los componentes de la matriz permanece en el sobrenadante. Deseche el sobrenadante. A continuación, agregue una solución de paraformaldehído al gránulo de organoide. El químico ingresa a las células organoides y se une a los aminoácidos, lo que provoca la reticulación de proteínas y la fijación de muestras. Este paso es vital para cualquier aplicación histológica posterior.

Peletice los organoides para separar y eliminar el sobrenadante que contiene paraformaldehído. Agregue agarosa derretida tibia a los organoides. Use una aguja para separar y dispersar los organoides granulados en la agarosa líquida. Deje que la agarosa se solidifique e incruste los organoides. Utilice el tapón de agarosa que contiene organoides para ensayos histológicos posteriores.

Para procesar los organoides para histología, retire los medios existentes del pozo teniendo cuidado de no aspirar las cúpulas de la membrana basal. Agregue un volumen igual de solución de recuperación celular e incube la placa durante 60 minutos a 4 grados centígrados.

Después de la incubación, desaloje la cúpula de la membrana basal con una pipeta y tritúrela con la punta de la pipeta. Recoja la cúpula disociada y la solución de recuperación celular en un tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar el tubo a 300 x g y 4 grados centígrados durante 5 minutos, luego retirar el sobrenadante y reservar.

Guarde todo el sobrenadante hasta el paso final cuando se confirme la presencia de organoides. Agregue el volumen deseado de PBS frío y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para desalojar mecánicamente el gránulo sin interrumpir los organoides. Repita la centrifugación y retire el sobrenadante.

Fije el gránulo en un volumen igualado de PFA al 4% durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después de la fijación, repita el paso de centrifugación y el lavado de PBS. Luego, agregue lentamente 200 microlitros de agarosa tibia al 2% e inmediatamente pero suavemente separe el gránulo celular de la pared del tubo sin interrumpirlo con una aguja de calibre 25 conectada a una jeringa de 1 mililitro.

Para el método de centrifugación de agarosa, es fundamental separar el gránulo celular de la pared del tubo justo después de agregar agarosa con una aguja de calibre 25.

Una vez que la agarosa se haya solidificado por completo, sepárela del tubo con una aguja de calibre 25 unida a una jeringa de 1 mililitro y transfiérala a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Llene el tubo con etanol al 70% y continúe con el protocolo convencional para la deshidratación de tejidos y la inclusión de parafina.

• Spin-down - A process to separate substances of different densities by centrifugation.
• Organoid paraffin embedding - A technique to preserve biological tissues in paraffin wax.
• Cell recovery solution - A solution used to dissociate cells from a matrix for further analysis.
• Agar embedding - A method to preserve tissue samples in an agarose gel block.
• Agarose embedding protocol - A detailed procedure for encasing biological samples in agarose.

• Introduce Spin-down – A method utilized to separate different-density particles by centrifugal force (e.g., spin-down).
• Key Concepts – Overview of tissue sample preservation techniques such as paraffin and agar embedding (e.g., organoid paraffin embedding).
• Underlying Mechanisms – Description of the procedure to detach and process organoids (e.g., cell recovery solution).
• Connect to Experiment – Explanation of the importance of proper organoid and agarose handling in the experiment.

• What is the spin-down technique and how is it applied in the procedure?
• How does organoid paraffin embedding contribute to tissue preservation?
• What role does cell recovery solution play during the dissociation of organoids?

• Practical Applications – Spin-down and embedding techniques in biological and medical research (e.g., spin-down).
• Industry Impact – Areas like pathology and histology benefit from these methods (e.g., organoid paraffin embedding).
• Societal Importance – Advancement in disease diagnosis and treatment (e.g., cell recovery solution).
• Link to Scientific Advancements – Development of improved tissue preservation and analysis methods.