Ensayo de espín de agarosa: una técnica para incrustar organoides para el análisis histológico

Los

cultivos de organoides 3D de células cancerosas recapitulan muchas características fisiopatológicas de los cánceres humanos. Por lo tanto, estos cultivos in vitro forman un excelente modelo para la investigación del cáncer.

Para procesar estos organoides, comience con un cultivo de organoides 3D preformados cultivados en una matriz de membrana basal adecuada. Agregue un medio de recuperación celular deseado e incube. El medio facilita la despolimerización del gel de matriz, liberando los organoides 3D en la solución.

Centrifuga esta mezcla para peletizar los organoides. El medio de recuperación que contiene los componentes de la matriz permanece en el sobrenadante. Deseche el sobrenadante. A continuación, agregue una solución de paraformaldehído al gránulo de organoide. El químico ingresa a las células organoides y se une a los aminoácidos, lo que provoca la reticulación de proteínas y la fijación de muestras. Este paso es vital para cualquier aplicación histológica posterior.

Peletice los organoides para separar y eliminar el sobrenadante que contiene paraformaldehído. Agregue agarosa derretida tibia a los organoides. Use una aguja para separar y dispersar los organoides granulados en la agarosa líquida. Deje que la agarosa se solidifique e incruste los organoides. Utilice el tapón de agarosa que contiene organoides para ensayos histológicos posteriores.

Para procesar los organoides para histología, retire los medios existentes del pozo teniendo cuidado de no aspirar las cúpulas de la membrana basal. Agregue un volumen igual de solución de recuperación celular e incube la placa durante 60 minutos a 4 grados centígrados.

Después de la incubación, desaloje la cúpula de la membrana basal con una pipeta y tritúrela con la punta de la pipeta. Recoja la cúpula disociada y la solución de recuperación celular en un tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar el tubo a 300 x g y 4 grados centígrados durante 5 minutos, luego retirar el sobrenadante y reservar.

Guarde todo el sobrenadante hasta el paso final cuando se confirme la presencia de organoides. Agregue el volumen deseado de PBS frío y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para desalojar mecánicamente el gránulo sin interrumpir los organoides. Repita la centrifugación y retire el sobrenadante.

Fije el gránulo en un volumen igualado de PFA al 4% durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después de la fijación, repita el paso de centrifugación y el lavado de PBS. Luego, agregue lentamente 200 microlitros de agarosa tibia al 2% e inmediatamente pero suavemente separe el gránulo celular de la pared del tubo sin interrumpirlo con una aguja de calibre 25 conectada a una jeringa de 1 mililitro.

Para el método de centrifugación de agarosa, es fundamental separar el gránulo celular de la pared del tubo justo después de agregar agarosa con una aguja de calibre 25.

Una vez que la agarosa se haya solidificado por completo, sepárela del tubo con una aguja de calibre 25 unida a una jeringa de 1 mililitro y transfiérala a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Llene el tubo con etanol al 70% y continúe con el protocolo convencional para la deshidratación de tejidos y la inclusión de parafina.