Ensayo de organoides prostáticos: una técnica de cultivo ex vivo basada en anillos de gel de matriz para estudiar la capacidad de diferenciación de las células epiteliales de la próstata

El epitelio prostático comprende principalmente células epiteliales basales y epiteliales luminales. Una monocapa de células basales forma el revestimiento externo de la glándula y apoya la supervivencia de las células luminales. Por el contrario, las células luminales recubren la luz y secretan proteínas específicas de la próstata.

Para estudiar la diferenciación epitelial prostática ex vivo, comience con una suspensión de células epiteliales basales de la próstata. Mezcle la suspensión con una matriz de membrana basal enfriada en la proporción deseada. Pipetea esta mezcla junto a la base de la pared interna de una placa de cultivo repelente de células. Gire la placa para que la mezcla forme un anillo a lo largo de la circunferencia del pozo.

Incube la placa para permitir que la matriz se solidifique. Complemente la cultura con un medio preferido. Los factores de crecimiento en el medio apoyan la proliferación de células epiteliales basales. Al mismo tiempo, la naturaleza repelente de células de la placa de cultivo evita la adhesión celular, lo que alienta a las células a formar esferoides 3D dentro de la matriz.

Con el tiempo, los esferoides desarrollan lúmenes bordeados con epitelio de múltiples capas. Las células epiteliales basales que recubren la luz eventualmente se diferencian y forman células luminales secretoras, dando lugar a estructuras glandulares 3D.

Comience este procedimiento con la preparación de células epiteliales prostáticas basales y luminales de ratón como se describe en el protocolo de texto. Lave el gránulo celular en 500 microlitros de medios organoides de ratón. Luego, vuelva a suspender el gránulo a una densidad celular de 1,000 células por microlitro. Para preparar mezclas maestras, mezcle células epiteliales suspendidas en medios organoides de ratón con gel de matriz para generar una mezcla final que contenga un 25% de células en medios y un 75% de gel de matriz. Dependiendo de la aplicación posterior, las células basales generalmente se siembran a una concentración de 100 a 2,000 celdas por 80 microlitros, mientras que las celdas luminales se siembran a una concentración de 2,000 a 10,000 celdas por 80 microlitros.

Para cada mezcla de células, agregue 80 microlitros del gel de matriz por pocillo de una placa de 24 pocillos. Pipetear una gota en la mitad inferior de la pared del pocillo evitando el contacto directo con el revestimiento de poli-HEMA. Después de agregar el gel de matriz, gire la placa para permitir que la mezcla de células de gel de matriz forme un anillo alrededor del borde del pozo. Coloque la placa de 24 pocillos en una incubadora de CO2 al 5% a 37 grados Celsius, con el lado derecho hacia arriba, durante 10 minutos para permitir que el gel de matriz se endurezca parcialmente.

Después de incubar durante 10 minutos, voltee la placa de 24 pocillos e incube durante 50 minutos más para permitir que el gel de matriz se endurezca por completo. Luego, agregue 350 microlitros de medios organoides de ratón precalentados, gota a gota, en el centro de cada pocillo. Después de agregar el medio, devuelva la placa de 24 pocillos a la incubadora.

Para reponer los medios organoides de ratón, incline la placa de 24 pocillos en un ángulo de 45 grados y retire suavemente los medios existentes del centro de cada pocillo con una pipeta P1000 evitando el anillo de gel de matriz. Agregue 350 microlitros de medios organoides de ratón precalentados como antes. Se recomienda agregar un mayor volumen de medios a los organoides cultivados durante más de cinco días para evitar el rápido agotamiento de nutrientes clave y factores de crecimiento.

• Prostate Epithelium - Consists of basal and luminal cells forming the prostate gland's structure.
• Basal Cells - Cells forming the outer lining of the prostate epithelium.
• Luminal Cells - Cells lining the lumen of the prostate gland and secreting prostate-specific proteins.
• 3D Spheroids - Cell structures formed in a cell-repellent environment.
• Organoid Assay - A method to study cell differentiation and formation of 3D glandular structures ex vivo.

• Introduction to Prostate Epithelium - It is formed of basal and luminal cells (e.g., prostate epithelial cells).
• Outline of Cellular Components - Basal cells support luminal cell survival; luminal cells line the lumen (e.g., organoid assay).
• Explanation of 3D Spheroids Formation - Grown within a matrix in a cell-repellent environment.
• Connection to Experiment - Formation of luminal cells from basal cells in 3D glandular structures.

• What are prostate epithelial cells and their role in the prostate epithelium?
• How does the organoid assay contribute to the study of prostatic epithelial differentiation?
• What is the process of 3D spheroids formation in a cell-repellent environment?

• Practical Applications - Used to study cell differentiation and formation of glandular structures ex vivo (e.g., organoid assay).
• Industry Impact - Crucial for biomedical research and development in urology (e.g., prostate health).
• Societal Importance - Contributes to better understanding and treatment of prostate diseases (e.g., prostate cancer).
• Scientific Advancements - Enabled the study of prostate cell proliferation and differentiation.