Extracción de lisado de proteínas: una técnica para lisar organoides para recolectar proteínas celulares

El lisado celular, o el líquido que contiene el contenido celular lisado, encuentra aplicación en procesos posteriores como extracciones y análisis de proteínas. El estudio de estas fracciones revela información sobre las características y funciones de las células.

Para preparar lisados de proteínas organoides, comience con un cultivo de organoides cultivados en una matriz de membrana basal deseada. Retire los medios de cultivo gastados del plato. Agregue medios tibios que contengan proteasas sobre la matriz. Pipetear repetidamente para desalojar la matriz del plato.

Incuba la mezcla. Las enzimas proteolíticas en el medio degradan la matriz y liberan los organoides en la solución. Centrifugar la muestra para separar los organoides del sobrenadante que contiene enzimas.

Vuelva a suspender el gránulo de organoide en un tampón de lisis de proteínas adecuado. Incubar la muestra. Los detergentes en el tampón alteran las membranas celulares de los organoides, liberando contenido intracelular en la solución. Al mismo tiempo, los inhibidores de proteínas en el tampón inactivan las enzimas proteasa y fosfatasa liberadas, evitando la degradación de sus proteínas sustrato.

Además, sonique la mezcla para alterar las células por completo. La envoltura nuclear se rompe y libera proteínas nucleares en la solución. Las ondas sónicas también cortan los ácidos nucleicos liberados, evitando que contaminen el lisado de proteínas.

Para recolectar organoides, limpie repetidamente el gel de la matriz pipeteando 1 mililitro de medios que contienen dispasa precalentados directamente sobre el anillo de gel de la matriz hasta que se desprenda todo el anillo. Transfiera la mezcla de organoides de gel de matriz desprendida a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Después de una digestión completa, como se describe en el protocolo de texto, agregue solución salina tamponada con fosfato al gránulo de organoide y vuelva a suspender moviendo suavemente.

Peletizar los organoides por centrifugación a 800 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante con una micropipeta. Vuelva a suspender los gránulos de organoides en 100 microlitros de tampón de lisis de proteínas por cada 10 microlitros de volumen celular empaquetado. Desliza para volver a suspender. Ahora, sonique los organoides sumergiendo los tubos en hielo húmedo y aplicando suavemente la punta del desmembrador sónico al exterior del tubo de microcentrífuga. Sonicar durante 40 segundos a 20 kHz antes de proceder a la transferencia occidental con los protocolos establecidos.