Imágenes de inmunofluorescencia de montaje completo: una técnica de fijación y tinción para evaluar organoides intactos

Los organoides prostáticos constituyen principalmente una capa externa de células epiteliales basales y capas internas de células epiteliales luminales dispuestas alrededor de una luz central.

Las imágenes de montaje completo permiten el estudio de organoides 3D intactos manteniendo su morfología y heterogeneidad. Para comenzar a teñir, trate los organoides con un fijador adecuado para bloquear sus componentes celulares en su lugar, preservándolos así. Lave la muestra para eliminar el exceso de fijadores.

Incubar con un cóctel de solución bloqueante y tinte de ADN. Las proteínas en la solución de bloqueo se unen pasivamente a sitios no específicos de las células y reducen cualquier tinción de fondo. Al mismo tiempo, el tinte de ADN tiñe los núcleos de las células.

Agregue dos conjuntos de anticuerpos primarios dirigidos a antígenos específicos expresados por las dos poblaciones de células constituyentes. Incubar con dos anticuerpos secundarios conjugados con colorantes fluorescentes diferentes que se unen a los anticuerpos primarios. Lave la muestra para eliminar cualquier anticuerpo no unido.

Sumerja los organoides teñidos secuencialmente en concentraciones crecientes de soluciones de azúcar que contienen tensioactivos para mejorar la transparencia del tejido sin comprometer la arquitectura del organoide. Este tratamiento mejora la profundidad de imagen de la muestra.

Monte los organoides en un portaobjetos de microscopio que lleve espaciadores para preservar su morfología 3D durante la obtención de imágenes. Utilice un microscopio confocal para observar las emisiones de fluorescencia de las poblaciones de células basales y luminales dispuestas alrededor de la luz central.

Para realizar la tinción de inmunofluorescencia de montaje completo de organoides de próstata, primero, agregue 500 microlitros de paraformaldehído al 4% en PBS. Incube los organoides durante 2 horas a temperatura ambiente agitando suavemente. Después de lavar el gránulo como se describe en el protocolo de texto, agregue 1 microgramo por mililitro de tinción DAPI en la solución de bloqueo e incube durante 2 horas a temperatura ambiente. Proteja la muestra de la luz durante la incubación a partir de este paso adelante. Después de la centrifugación de los organoides como antes, agregue el anticuerpo primario y la solución de bloqueo e incube durante la noche a 4 grados centígrados con agitación suave.

Vuelva a granular los organoides y lave el gránulo con 1 mililitro de PBS durante 15 minutos agitando suavemente. Repita este procedimiento de lavado dos veces. Luego, agregue el anticuerpo secundario y la solución de bloqueo e incube durante la noche a 4 grados centígrados con agitación suave. Después de la incubación, granular los organoides y lavar el gránulo dos veces más. Agregue 1 mililitro de sacarosa al 30% en PBS con Triton X-100 al 1% a los organoides granulados. Luego, incube durante 2 horas a temperatura ambiente agitando suavemente.

Después de volver a granular los organoides, agregue 1 mililitro de sacarosa al 45% en PBS con Triton X-100 al 1% y agite suavemente durante 2 horas a temperatura ambiente. Luego, repita el procedimiento, excepto que agregue 1 mililitro de sacarosa al 60% en PBS con Triton X-100 al 1%. Granular los organoides por centrifugación a 800 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente y eliminar el 95% del sobrenadante. Observe el gránulo bajo luz ultravioleta para confirmar que no se perdió durante la eliminación del sobrenadante. El gránulo se afloja a medida que aumenta la concentración de sacarosa. Transfiera de 10 a 20 microlitros de la suspensión restante a un cubreobjetos con cámara y proceda a la microscopía confocal.