Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Investigación sobre el cáncer
0 visualizaciones • 2:30 min. • April 30th, 2023
La microdisección por captura láser ayuda a obtener una sola célula diana a partir de una mezcla de células preparada en un portaobjetos de vidrio. Comience tomando un portaobjetos de vidrio adecuado recubierto con una membrana bioquímicamente inerte y permeable a los rayos UV en su superficie. Exponga el portaobjetos a la luz ultravioleta para que sea más hidrófilo y mejore la adherencia celular.
Ensamble el portaobjetos en un aparato de citocentrífuga. Agregue suspensión celular en el puerto del embudo del aparato. Citocentrífuga para permitir que la fuerza centrífuga se concentre y deposite una monocapa de células en un área pequeña en el portaobjetos de vidrio. Deje que la diapositiva se seque al aire.
Coloque el portaobjetos, con la muestra hacia arriba, bajo un microscopio de microdisección láser. Defina la región que rodea la celda de interés. Ahora, enfoque el rayo láser para diseccionar la región que contiene la célula diana junto con el recubrimiento de la membrana. A continuación, desenfoque el rayo láser y púlmelo para generar presión. Esta energía catapulta la región microdiseccionada hacia la tapa invertida de un tubo de recolección preensamblado que contiene un tampón colocado sobre el portaobjetos.
Recupere el tubo y cierre su tapa. Gire el tubo para llevar el tampón que contiene la celda objetivo única al fondo del tubo. Refrigere el tubo hasta un análisis adicional.
Para la microdisección con láser, citocentrifugar los 300 microlitros completos de suspensión celular en un portaobjetos recubierto de membrana a 300 x g durante 5 minutos. Luego, coloque el portaobjetos recubierto de membrana en un microscopio capaz de microdisección láser. A continuación, pipetee 4,5 microlitros de mezcla maestra de lisis celular en la tapa del tubo de PCR de 0,2 mililitros.
Coloque la tapa sobre la muestra y recolecte una sola célula mediante microdisección láser. Inmediatamente después, verifique si hay células aisladas en la tapa de PCR. Retire el tubo de PCR del microscopio de microdisección láser y ciérrelo. Recoja todo el líquido en el fondo del tubo con un giro corto.