Caracterización funcional de la quimiorresistencia: un método para evaluar la resistencia a los medicamentos en células cancerosas mediante ensayos clonogénicos

Para evaluar la quimiorresistencia en las células cancerosas, comience tomando una placa de pocillos múltiples. Siembre una suspensión de las células cancerosas de próstata sensibles a los medicamentos deseadas en unos pocos pocillos y una suspensión de la variante resistente a los medicamentos de las células en los pocillos restantes.

Incubar el cultivo para facilitar la unión de las células a la placa de cultivo. Trate ambos tipos de células con un rango de dosis crecientes de la solución farmacológica seleccionada. Las moléculas del fármaco ingresan a las células sensibles y causan la muerte celular incluso en sus concentraciones más bajas. Sin embargo, las células resistentes expulsan las moléculas del fármaco a través de bombas especializadas de salida del fármaco, lo que permite su supervivencia a pesar de estar expuestas a concentraciones más altas del fármaco.

Aspire los medios gastados que contienen desechos y solución farmacológica. Complemente con medios de cultivo frescos sin medicamentos. Incubar para permitir que las células resistentes a los medicamentos sobrevivientes proliferen y formen colonias. Agregue una solución de tinción adecuada para colorear las colonias de células vivas.

Lave el cultivo para eliminar el exceso de tinte. Cuente el número de colonias de colores en cada pozo. Los pocillos que contienen células sensibles a los medicamentos contienen muy pocas colonias viables. Por el contrario, los pocillos que contienen células resistentes a los medicamentos exhiben un mayor número de colonias. Sin embargo, estas células resistentes a los medicamentos muestran una reducción en el número de colonias con dosis crecientes de medicamentos.

En este procedimiento, coloque placas de 2.000 células utilizando 2 mililitros de medios por pocillo en las placas de 6 pocillos. Después de 24 horas, agregue concentraciones crecientes de docetaxel para las líneas celulares DU145 y 22Rv1. Agregue DMSO solo a un pocillo como control al mismo volumen utilizado para la dosis más alta de docetaxel. Después de 72 horas, aspire el medio que contiene el medicamento y agregue medios nuevos sin docetaxel.

Incube las placas durante 1 a 2 semanas hasta que las colonias sean visibles bajo el microscopio. Para teñir las colonias, lávelas suavemente con 2 a 3 mililitros de PBS e incube con 2 a 3 mililitros de solución violeta cristalina durante 20 minutos dentro de la campana de cultivo de tejidos o una campana

extractora.

Luego, retire la solución de tinción y lave las placas con 2 a 3 mililitros de agua. Luego, retire el agua y seque al aire los platos. Tome imágenes digitales de las placas para la representación de figuras. Analice el resultado visualizando los pocillos y contando manualmente las colonias con la ayuda de un rotulador y represente el porcentaje de viabilidad celular en un gráfico.