Inducción de autofagia basada en ADI en células de cáncer de próstata: una técnica basada en enzimas para medir la respuesta autofágica en células

La autofagia es un proceso intracelular que facilita la degradación de componentes citoplasmáticos y orgánulos no deseados dentro de compartimentos digestivos especializados llamados lisosomas. Para evaluar la autofagia, comience con un cultivo adherente de células de cáncer de próstata que expresan proteínas marcadoras autofágicas llamadas LC3 acopladas a proteínas fluorescentes verdes.

Inherentemente, las células cancerosas de próstata carecen de la enzima argininosuccinato sintasa necesaria para la síntesis de aminoácidos arginina. Por lo tanto, estas células dependen de la suplementación externa con arginina a través de medios para sobrevivir y proliferar.

A continuación, trate las células con arginina deiminasa o IDA. La IDA hidroliza la arginina libre en el medio, lo que lleva al agotamiento de la arginina. En consecuencia, las células sufren estrés metabólico, iniciando una respuesta autofágica internamente. Simultáneamente, trate las células con un tinte rojo fluorescente que etiqueta los lisosomas dentro de las células.

Durante la autofagia, las estructuras membranosas en forma de copa llamadas fagóforos se ensamblan alrededor de los componentes citoplasmáticos dañados. Eventualmente, expanden y sellan su carga mientras se conjugan con proteínas marcadoras autofágicas LC3 para formar vesículas o autofagosomas de doble membrana. Las proteínas LC3 también proporcionan etiquetas fluorescentes a los autofagosomas. Luego, las vesículas se fusionan con los lisosomas para formar autolisosomas. Las proteasas lisosomales dentro de los autolisosomas degradan los componentes celulares engullidos.

En tiempo real, observe la fluorescencia brillante de los autofagosomas y lisosomas para determinar su distribución dentro de las células.

Para comenzar, cultive células de cáncer de próstata humano que expresen la cadena ligera 3 acoplada a proteínas fluorescentes verdes en placas de cultivo de fondo de vidrio recubiertas de poli-D-lisina de 35 milímetros, como se describe en el protocolo de texto.

Las células deben estar sembradas a una densidad suficiente para facilitar una proliferación rápida, pero no tanto como para que las células crezcan demasiado y se agrupen en el momento de la obtención de imágenes. Tratar muestras de células seleccionadas con arginina desaminasa, o IDA, en PBS para agotar las células de arginina libre e inducir estrés metabólico en las células cancerosas.

Aproximadamente una hora antes de la obtención de imágenes, diluya 1,5 microlitros de LysoTracker Red con 20 mililitros de RPMI que contengan un 10% de FBS y un 1% de antibióticos. Preparar soluciones con ADI para las muestras seleccionadas que fueron tratadas.

Después de calentar todos los medios a 37 grados centígrados, agregue los medios apropiados a cada plato de cultivo. Incube las células con RPMI que contengan LysoTracker Red durante 15 a 45 minutos a 37 grados Celsius.

Aproximadamente 30 minutos antes de la toma de imágenes, encienda el recinto ambiental de la estación meteorológica y permita el equilibrio a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Lave las células con PBS y reemplace los medios con RPMI estándar que contenga solo un 10% de FBS y un 1% de antibióticos.

Agregue ADI a las muestras como se indica. Monte placas de cultivo con fondo de vidrio de 35 milímetros en un adaptador personalizado. Utilice aceite de inmersión en la lente del objetivo de apertura numérica de 1,42 y aumento de 60X y coloque la placa de cultivo montada en la platina del microscopio.

• Autophagy - An intracellular process that degrades unwanted cytoplasmic components.
• Argininosuccinate Synthase - An enzyme absent in prostate cancer cells essential for arginine synthesis.
• Arginine Deiminase (ADI) - Enzyme that hydrolyzes free arginine in media, causing cell stress.
• LC3 Proteins - Autophagic marker proteins that provide fluorescent tags to autophagosomes.
• Lysotracker Red DND-99 - A dye used to label lysosomes within cells during autophagy.

• Introduce Autophagy - A degradative process eliminating unwanted parts in cells (e.g., autophagy video).
• Outline Prostate Cancer Cells - Lacking an enzyme, they depend on external arginine sources (e.g., prostate enzyme).
• Explain Induction of Autophagy - ADI depletes arginine causing autophagy in the cells (e.g., autophagy induction).
• Connect to Experiment - The cells are simultaneously treated with lysotracker red DND-99 (e.g., autophagy dye).

• What is autophagy and how does it relate to prostate cancer cells (include ADI)?
• What are LC3 proteins and their role in autophagy?
• How does Arginine Deiminase initiate an autophagic response in cells?

• Practical Applications - Autophagy serves as a potential target for prostate cancer treatment (e.g., autophagy and prostate cancer).
• Industry Impact - Autophagy research benefits healthcare and pharmaceutical sectors (e.g., prostate cancer enzyme marker).
• Societal Importance - Observing real-time autophagy in cells can inform disease treatments (e.g., autophagy videos).
• Link to Scientific Advancements - Dyes like lysotracker red dnd-99 help visualize cellular processes.