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Comience con una muestra de tejido tumoral de próstata. Vuelva a suspenderlo en un tampón de lisis frío para iniciar la lisis celular. Use un homogeneizador para descomponer aún más las estructuras del tejido y liberar sus componentes intracelulares. Sonicar la muestra en hielo para asegurar una lisis celular completa y cortar el ADN para evitar interferencias durante el procesamiento de péptidos. Caliente el lisado para alterar la estructura terciaria de las proteínas y desplegarlas.
Los agentes reductores en el tampón escinden los enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína. Posteriormente, los agentes alquilantes en el tampón alquilan grupos tiol libres de cisteínas reducidas para evitar la reformación del enlace disulfuro. Los agentes desnaturalizantes adicionales en el tampón facilitan la desnaturalización controlada y el despliegue posterior de las proteínas.
Centrífuga para peletizar los restos de tejido y cualquier contaminante. Recoja el sobrenadante que contiene la mezcla de proteínas en un tubo nuevo. Agregue la enzima lisil endopeptidasa para escindir los enlaces peptídicos en las proteínas en el extremo C de los residuos de lisina, formando péptidos grandes. Además, trate con la enzima tripsina para escindir los enlaces peptídicos en el extremo C de los residuos de lisina y arginina y generar péptidos más pequeños. Transfiera la mezcla a una unidad de filtro centrífugo.
Centrifugar para permitir que los péptidos digeridos penetren a través de los poros de la membrana del filtro y se acumulen como flujo. Cualquier fragmento más grande permanece como el retenido.
Para recolectar tejido tumoral, pese el tumor y, en un tubo de ensayo de cultivo, agregue 2 mililitros de tampón de lisis helado por cada 100 miligramos de tejido. Luego, use un homogeneizador de mano o de sobremesa para homogeneizar el lisado.
Para reducir y alquilar la muestra, caliente el tubo a 95 grados centígrados durante 5 minutos, luego enfríe la muestra en hielo durante 15 minutos. Mientras aún está en hielo, sonique el lisado tres veces. Luego, caliente la muestra a 95 grados centígrados durante 5 minutos.
Coloque este tubo de sonicación en un rotor de cubo oscilante y centrifugue el lisado a 3.500 x g y 15 grados centígrados durante 15 minutos. Luego, recoge el sobrenadante y desecha el gránulo. Para digerir el lisado, use Tris 100 milimolares para diluir la muestra 12 veces para reducir la cantidad de guanidinio. Para 5 miligramos de proteína, agregue 10 microgramos de lisil endopeptidasa, o Lys-C, e incube la muestra a temperatura ambiente durante 5 a 6 horas.
Prepare 1 miligramo por mililitro de tripsina tratada con TPCK en HCl 1 milimolar con cloruro de calcio y tripsina agregados en una proporción de 1 a 100 tripsina a proteína. Incube la muestra a 37 grados centígrados durante 3 horas. Luego, agregue una alícuota adicional de tripsina al tubo e incube la muestra a 37 grados centígrados durante la noche.
Agregue la muestra a un filtro de corte de 15 mililitros y 10 kDa. Centrifugar la muestra en un cubo oscilante o rotor de ángulo fijo a 3.500 x g y 15 grados centígrados hasta que el volumen retenido sea inferior a 250 microlitros. Luego, recoja el flujo continuo y deseche el retenido.