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Investigación sobre el cáncer
0 vistas • 4:50 min • April 30th, 2023
La fosforilación de residuos de aminoácidos específicos, como la tirosina, genera fosfopéptidos que desempeñan un papel fundamental en la regulación de varias vías de señalización celular. Su estudio permite identificar posibles biomarcadores para la terapia del cáncer.
Para aislar fosfopéptidos, comience con un polvo liofilizado de digestión de péptidos purificados extraídos del tejido canceroso. Vuelva a suspender el polvo en un tampón adecuado para preparar una suspensión peptídica uniforme. Mantenga un pH neutro para garantizar la estabilidad de los péptidos.
Prepare una suspensión que consista en perlas de hidrogel conjugadas con anticuerpos antifosfopéptidos específicos en el tampón deseado. Agregue la suspensión de perlas a la suspensión de péptidos. Los anticuerpos inmovilizados en las perlas reconocen y se unen a sus residuos específicos de aminoácidos fosforilados dentro de los fosfopéptidos, formando complejos.
Centrifugar la mezcla para recoger los complejos fosfopéptido-perlas en el gránulo. Retire el sobrenadante que contiene péptidos no unidos o fosfopéptidos no específicos. Agregue un tampón de elución de pH bajo adecuado a los complejos e incube. El pH bajo debilita la interacción entre los residuos de fosfopéptidos y los complejos de perlas de anticuerpo, liberando los péptidos en la solución.
Transfiera la mezcla a un cartucho de filtro preensamblado. Centrifugar para eluir los fosfopéptidos liberados en el tubo de recolección. Concentre la muestra al vacío a una temperatura elevada para eliminar el tampón y obtener un gránulo seco concentrado de fosfopéptidos puros.
Vuelva a suspender el polvo liofilizado con 0,5 mililitros de tampón de unión de inmunoprecipitación helada, o IP, en cada fracción. Transfiera el volumen de resuspensión de 0,5 mililitros de la segunda fracción al tubo con la primera fracción y guarde la punta de la pipeta. Use otros 0,5 mililitros de tampón IP para enjuagar cada tubo de liofilización antes de transferir el contenido al criotubo. Luego, repita el enjuague con 2 mililitros de búfer IP.
Después de usar P200 con una punta cortada para transferir el stock de 0,5 miligramos por mililitro de lechada de perlas de anticuerpos al tubo de microfuga, agregue 450 microlitros de tampón de unión IP helado para lavar 50 microlitros de suspensión de perlas de anticuerpos 4G10 y 25 microlitros de suspensión de perlas de anticuerpos 27B10.4 en un tubo de microfuga. Centrifugar el tubo a 100 x g y 4 grados centígrados durante 1 minuto. Después de aspirar el sobrenadante, agregue un volumen igual que la suspensión original del tampón de unión IP para volver a suspender las perlas. Agregue perlas de pY prelavadas a la solución de muestra resuspendida en los criotubos con tapón de rosca. Luego, incube a 4 grados centígrados en un rotador de extremo a extremo durante la noche. Después de girar las perlas, guarde el sobrenadante, que se utilizará para enriquecer los péptidos pST.
A continuación, use 300 microlitros de tampón de unión IP para volver a suspender las perlas y transferirlas a un tubo de microcentrífuga de 2 mililitros. Centrifugar las muestras a 100 x g y 4 grados centígrados durante 1 minuto. Luego, con 500 microlitros de tampón de unión IP, lave las perlas tres veces. Lave las perlas cuatro veces con 450 microlitros de bicarbonato de amonio 25 mM, pH 7,5. Sumerja una punta de carga de gel ligeramente por debajo de la superficie del cordón y aspire completamente el sobrenadante. Agregue cuatro veces el volumen de cuentas de 0.1% TFA a las cuentas.
Luego, mézclalos bien e incuba el tubo en un termomezclador a 1.000 rpm y 37 grados centígrados durante 15 minutos. Transfiera la resuspensión a un filtro giratorio de 0,2 micrómetros y centrifugue el filtro a 850 x g durante 1 minuto. Después de transferir la elución a un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas, concentre al vacío el eluido hasta que se seque a 40 grados Celsius con un tiempo de calor de 300 minutos durante la noche.