Conversión de bisulfito del ADN genómico: un método para estudiar la metilación del ADN en muestras de ADN genómico de tejido de cáncer gastrointestinal

La metilación del ADN implica la adición de grupos metilo a los residuos de citosina del ADN para formar metilcitosina, lo que provoca la alteración del ADN y la regulación de la expresión génica.

Para estudiar la metilación del ADN, comience tomando extracto de ADN crudo de células cancerosas. Agregue un tampón de dilución e incube a temperatura ambiente. El tampón diluye la mezcla y desnaturaliza el ADN bicatenario en ADN monocatenario, favoreciendo la accesibilidad de las bases para reacciones posteriores.

Agregue un reactivo de conversión e incube en la oscuridad. El bisulfito de sodio en el reactivo desencadena la sulfonación y la posterior desaminación de los residuos de citosina no metilados, lo que da como resultado la formación de uracilo-sulfonato. Sin embargo, los residuos de citosina metilada permanecen sin cambios.

A continuación, complemente el ADN con un tampón de unión y transfiéralo a una columna de filtro de espín preensamblada. El tampón ayuda al ADN a unirse al filtro.

Centrifugar para eliminar la mezcla de tampón y reactivo de bisulfito del ADN atrapado en la columna. Deseche el flujo continuo. Agregue un tampón de desulfonación alcalina al ADN. El tampón ayuda a eliminar el grupo sulfito del uracilo-sulfonato para formar uracilo.

Centrifugar para eliminar el tampón gastado. Ahora, agregue un tampón de elución a la columna para eluir el ADN convertido. Realice PCR para amplificar el ADN. Todos los residuos de uracilo convertidos se amplifican como timinas, mientras que los residuos de citosina metilada se amplifican como citosinas.

Secuenciar los residuos de citosina del ADN amplificado para generar un perfil de metilación de la muestra.

Realice el tratamiento con bisulfito en 45 microlitros del tejido digerido utilizando un kit de conversión de bisulfito de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Agregue 5 microlitros de tampón de dilución a la muestra e incube a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Mientras tanto, prepare el reactivo de conversión de bisulfito agregando 750 microlitros de agua destilada y 210 microlitros de tampón de dilución a un tubo de reactivo de conversión CT. Mezcle los tubos en vórtice durante 10 minutos. Luego, agregue 100 microlitros del reactivo de conversión de TC preparado a cada muestra y mezcle por inversión.

Incube las muestras en la oscuridad a 50 grados centígrados durante 12 a 16 horas. Después de la incubación, coloque las muestras en hielo durante 10 minutos. Agregue 400 microlitros de tampón de unión y mezcle cada muestra pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Cargue cada muestra en una columna de centrifugación y coloque la columna en un tubo de recolección de 2 mililitros. Centrifugar las muestras a máxima velocidad durante 1 minuto y desechar el flujo. Agregue 200 microlitros de tampón de lavado a cada columna y gire a toda velocidad durante 1 minuto, luego deseche el flujo.

Agregue 200 microlitros de tampón de desulfonación a cada columna y deje reposar las columnas a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de la incubación, gire las columnas a toda velocidad durante 1 minuto y deseche el flujo. Lave la columna dos veces con 200 microlitros de tampón de lavado, centrifugando durante 1 minuto a máxima velocidad después de cada lavado.

Agregue 46 microlitros de agua destilada a cada columna y colóquela en un nuevo tubo estéril de polipropileno de un solo uso de 1,5 mililitros. Gire los tubos durante 2 minutos para eluir el ADN y deseche la columna. El ADN ya está listo para el análisis. Utilice el ADN modificado con bisulfito como plantilla para la PCR cuantitativa específica de metilación para evaluar la metilación de la región promotora en cada análisis de genes. Combine los reactivos como se describe en el manuscrito del texto y use un instrumento de PCR en tiempo real de 96 pocillos para ejecutar el protocolo de ciclo térmico.