Microscopía de fluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos o NETs: una técnica para observar la interacción adhesiva entre las células cancerosas y los NETs

En condiciones patológicas como el cáncer, los neutrófilos activados liberan trampas extracelulares de neutrófilos o NET, una malla de ADN extracelular con enzimas asociadas y proteínas antimicrobianas, que atrapan las células cancerosas circulantes.

Para visualizar la interacción adhesiva entre los NET y las células tumorales in vitro, comience cultivando neutrófilos de baja densidad, un subtipo de neutrófilos, en una placa de cultivo recubierta de polímero que promueve la unión celular. Incube durante unas horas para estimular a los neutrófilos para que formen NET en forma de red.

Agregue una suspensión de células cancerosas marcadas con fluoresceína roja al cultivo de neutrófilos. Incubar las células cancerosas con NET durante un breve período para facilitar la interacción entre las células cancerosas y las NET. El NET-DNA actúa como un factor quimiotáctico que atrae a las células cancerosas y promueve su adhesión a los NET.

Retire el medio gastado. Lave suavemente el cultivo con un medio fresco adecuado para eliminar bien cualquier célula tumoral no adherida del cultivo.

Ahora, agregue una tinción nuclear fluorescente verde impermeable a la membrana para colorear los NET extracelulares de forma selectiva. Observe el cultivo bajo un microscopio de fluorescencia. Las trampas extracelulares de neutrófilos aparecen como estructuras verdes en forma de cuerdas que forman una malla a la que se unen las células tumorales rojas.

Vuelva a suspender los neutrófilos aislados de baja densidad a 5 veces 10 a las seis células por mililitro de medio RPMI 1640 suplementado con concentración de FBS y siembre 1 mililitro de neutrófilos por pocillo en una placa recubierta de poli-L-lisina de 6 pocillos. Después de 2 horas a 37 grados Celsius y dióxido de carbono al 5%, tiña las células de cada pocillo con un colorante nuclear y cromosómico impermeable a la membrana fluorescente adecuado de acuerdo con las instrucciones del fabricante y observa inmediatamente la morfología de los NET mediante microscopía de fluorescencia.

Para evaluar la adhesión de las células tumorales a los TNE, resuspenda las células tumorales gástricas teñidas con un colorante fluorescente contrastante a una velocidad de 1 x 10 a la sexta por mililitro de RPMI 1640 suplementado con una concentración de albúmina sérica bovina de 0,1% y agregue 1 mililitro de células tumorales a cada pocillo de los cultivos de neutrófilos de baja densidad. Después de 5 minutos a 37 grados centígrados, retire el sobrenadante de cada pocillo y lave suavemente las células dos veces con 2 mililitros de medio RPMI 1640 precalentado suplementado con BSA por lavado.

Una incubación de 5 minutos es suficiente para detectar la unión específica de NET. Agregue el medio tibio a un lado de cada pocillo lentamente, gire suavemente la placa y retire el sobrenadante con un aspirador.

Los NET y las células tumorales adheridas se pueden observar mediante microscopía de fluorescencia.