Microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo de trampas extracelulares de neutrófilos o NET: una técnica para analizar la interacción posterior a la adhesión entre las células cancerosas y los NET

Durante condiciones patológicas como el cáncer, los neutrófilos activados liberan trampas extracelulares de neutrófilos o NET, una red de fibras de ADN extracelulares asociadas con histonas y enzimas proteolíticas. Estas estructuras atrapan las células cancerosas y desempeñan un papel clave en la metástasis del cáncer.

Para estudiar el comportamiento posterior a la adhesión de las células cancerosas atrapadas en NET in vitro, primero, cultivar neutrófilos de baja densidad, una subpoblación de neutrófilos, en una placa de cultivo recubierta de polímero que facilita la unión celular. Incubar para activar los neutrófilos para liberar NET en forma de malla.

A continuación, agregue un tinte nuclear fluorescente verde impermeable a la membrana para teñir las fibras de ADN en los NET específicamente. Retire el medio gastado. Agregue una suspensión de células cancerosas al cultivo de neutrófilos.

Incubar el cultivo durante un período corto para facilitar la interacción entre las células cancerosas y la red. El componente de ADN de los NET funciona como un factor quimiotáctico que estimula la migración de las células cancerosas y ayuda a su adhesión a los NET.

Retire el medio gastado. Enjuague suavemente el cultivo con medios nuevos apropiados para eliminar cualquier célula cancerosa no unida de la placa de cultivo. Reponga con un medio fresco que contenga suero.

Obtener imágenes del cultivo durante un período prolongado utilizando microscopía de video de lapso de tiempo para analizar los eventos interactivos entre los NET y las células cancerosas. Con el tiempo, los NET proporcionan un microambiente adecuado que facilita la proliferación de células cancerosas. Utilice un software adecuado para observar la proliferación de células cancerosas en NET fluorescentes verdes.

Cultivar y teñir los neutrófilos peritoneales de baja densidad en una placa de 35 milímetros, placa recubierta de poli-L-lisina como se demostró, seguido de un breve lavado en 2 mililitros de BSA al 0,1% más RPMI 1640.

Reemplace el medio con 1 por 10 a la sexta células tumorales gástricas sin teñir suspendidas en 2 mililitros de RPMI suplementadas con BSA para una incubación de 5 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, enjuague las células en 2 mililitros de RPMI fresco suplementado con BSA durante 5 minutos a temperatura ambiente, seguido de un remolino suave para eliminar cualquier célula tumoral no adherida.

Luego, reemplace el sobrenadante con DMEM suplementado con FBS y antibióticos y monte el plato en un sistema de observación celular de vista completa para el análisis de lapso de tiempo de la captura de células tumorales por parte de los NET.