Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Investigación sobre el cáncer
0 visualizaciones • 3:43 min. • April 30th, 2023
Los exosomas son las estructuras vesiculares extracelulares secretadas por las células cultivadas en el sobrenadante. Para preparar un bloque de exosomas, comience tomando un sobrenadante de cultivo que contenga exosomas en un tubo. Centrifugar el tubo a alta velocidad para peletizar los exosomas intactos. Deseche el sobrenadante restante.
Tratar el gránulo del exosoma con glutaraldehído presente en el tampón de fijación. Incube la mezcla en hielo durante el tiempo deseado para preservar la morfología de los exosomas. El glutaraldehído se infiltra en los exosomas y reticula las proteínas. El tampón de fijación mantiene los exosomas a pH neutro para el proceso de fijación posterior.
Deseche el tampón que contiene glutaraldehído y agregue una solución de tetróxido de osmio, un fijador secundario que permeabiliza la bicapa de la membrana y fija los lípidos presentes en los exosomas. Retire la solución de tetróxido de osmio y trate los exosomas con una serie de concentraciones crecientes de acetona. Este proceso deshidrata los exosomas.
Reemplace la acetona absoluta con la mezcla de acetona media de inclusión. Gradualmente, aumente la proporción de medio de inclusión en esta mezcla.
Vierta la mezcla de inclusión que contiene exosomas en los moldes deseados. Seque los moldes al horno a alta temperatura. Esto conducirá a la polimerización del medio de inclusión alrededor de los exosomas, dando lugar a bloques.
Para fijar el gránulo de exosoma purificado, agregue 1 mililitro de glutaraldehído al 2,5% en una solución de cacodilato de sodio 0,1 M a pH 7,0. Incube las vesículas de la bicapa lipídica durante 1 hora a 4 grados centígrados. A continuación, retire el fijador y enjuague los gránulos con 1 mililitro de una solución tampón de cacodilato de sodio 0,1 M a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Luego, fije las muestras con 1 mililitro de tetróxido de osmio al 2% durante 1 hora a 4 grados centígrados. Retire el fijador y enjuague el gránulo de exosoma tres veces con el tampón de cacodilato de sodio 0,1 M, cambiando el tampón cada 10 minutos. Luego, deshidrate la muestra agitándola durante 10 minutos cada una en una serie de concentraciones de acetona graduadas.
A continuación, mezcle una solución de tres partes de acetona y una parte de mezcla de inclusión de baja viscosidad. Reemplace la acetona con esta mezcla e incube la muestra durante 30 minutos. Continúe aumentando la proporción del medio de inclusión de baja viscosidad, incubando durante 30 minutos con cada paso.
Finalmente, incube el gránulo del exosoma en el 100% de la mezcla de inclusión de baja viscosidad durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, incruste la muestra en una mezcla de inclusión pura de baja viscosidad utilizando un molde de inclusión y hornee durante 24 horas a 65 grados centígrados.