Seccionamiento, tinción e imágenes TEM de exosomas incrustados: un protocolo para visualizar las características estructurales de los exosomas mediante TEM
JoVE Encyclopedia of Experiments
Investigación sobre el cáncer
0 vistas • 2:32 min • April 30th, 2023
Los exosomas son vesículas esféricas de tamaño nanométrico encerradas por una bicapa lipídica que contiene moléculas de ADN, ARN y proteínas presentes dentro de la luz.
Para visualizar la estructura del exosoma mediante microscopía electrónica de transmisión, o TEM, comience tomando un bloque de exosomas, un bloque de matriz sólida que contiene los exosomas incrustados. Usando un ultramicrotomo, obtenga secciones ultrafinas del bloque de exosomas.
Recoja la sección del exosoma en una rejilla adecuada y deje que se adhiera a la superficie. La rejilla proporciona un soporte estable a la muestra del exosoma para los pasos posteriores de tinción.
A continuación, coloque la rejilla sobre una gota de acetato de uranilo, una mancha de metal pesado, e incube durante el tiempo deseado. Los iones de uranilo interactúan con lípidos, proteínas, ADN y ARN presentes en los exosomas.
Posteriormente, tiña la sección del exosoma con citrato de plomo, que también se une a las biomoléculas exosomales. El citrato de plomo se une débilmente a los iones de uranilo preunidos y mejora el contraste con el fondo durante la obtención de imágenes.
Observe los exosomas doblemente teñidos usando TEM. TEM enfoca el haz de electrones en la muestra de exosoma. Las regiones teñidas en el exosoma dispersan los electrones con más fuerza en comparación con las regiones no teñidas.
La apertura del objetivo filtra estos electrones altamente dispersos. Por lo tanto, los exosomas que contienen biomoléculas teñidas aparecen más oscuros que el fondo.
Con un ultramicrotomo, prepare secciones con un grosor de 60 nanómetros. Coloque las secciones en una rejilla de níquel y tiñe dos veces algunas de ellas con acetato de uranilo al 2% durante 20 minutos, seguido de citrato de plomo durante 10 minutos. A continuación, coloque la sección teñida en un microscopio electrónico de transmisión y vea la muestra usando 80 kV y siga la configuración automática para el tiempo de exposición. Con una imagen de exosoma a la vista, adquiera y guarde la imagen utilizando el software del microscopio.
Resumen
Este artículo trata sobre la visualización de exosomas mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Detalla los procesos de preparación y tinción necesarios para mejorar el contraste de las estructuras exosomales en la obtención de imágenes.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Biofísica
Antecedentes
- Los exosomas son vesículas de tamaño nanométrico implicadas en la comunicación intercelular.
- Contienen diversas biomoléculas, incluyendo ADN, ARN y proteínas.
- La microscopía electrónica de transmisión es una herramienta poderosa para visualizar estructuras celulares.
- Las técnicas de tinción son cruciales para mejorar el contraste de la imagen en MET.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para la preparación de exosomas para la visualización mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM).
- Demostrar los efectos de diferentes métodos de tinción en la visualización de exosomas.
- Destacar la importancia de la estructura de los exosomas en la investigación biológica.
Métodos Utilizados
- Preparación de bloques de exosomas utilizando un ultramicrotomo.
- Tinción con acetato de uranilo y citrato de plomo.
- Observación mediante microscopía electrónica de transmisión a 80 kV.
- Adquisición y guardado de imágenes utilizando el software del microscopio.
Resultados principales
- Los exosomas teñidos aparecen más oscuros frente al fondo en las imágenes de microscopía electrónica de transmisión.
- Secciones ultradelgadas de 60 nanómetros son óptimas para la obtención de imágenes.
- El acetato de uranilo y el citrato de plomo mejoran eficazmente el contraste.
- El protocolo permite la visualización clara de las estructuras exosomales.
Conclusiones
- Los métodos descritos proporcionan una visualización confiable de los exosomas.
- Las técnicas de tinción son fundamentales para mejorar la calidad de la imagen en microscopía electrónica de transmisión (TEM).
- Este protocolo puede ayudar a los investigadores a estudiar la biología de los exosomas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La visualización de alta resolución de las características estructurales de los exosomas mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) es fundamental para la investigación temprana en biofármacos, ya que permite la caracterización precisa de vesículas a escala nanométrica implicadas en la comunicación intercelular. Los protocolos de imagen fiables apoyan la validación de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas al confirmar la integridad de los exosomas y su contenido biomolecular. Esta capacidad fortalece la confianza predictiva en puntos críticos del descubrimiento e informa las decisiones de selección de carteras.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la visualización directa de la morfología de los exosomas para respaldar los esfuerzos de validación de objetivos.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas al confirmar la presencia y estructura de las biomoléculas exosomales.
- Apoya la confianza predictiva en hipótesis basadas en exosomas para modelos de enfermedades.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona salidas de imagen estandarizadas para el desarrollo de ensayos y la validación de sistemas.
- Asegura la reproducibilidad y comparabilidad de las preparaciones de exosomas entre experimentos.
- Ofrece datos estructurales cuantitativos para orientar los flujos de trabajo de cribado posteriores.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea la caracterización de exosomas con estrategias traslacionales de biomarcadores cuando se utilizan exosomas como indicadores relevantes para enfermedades.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la confirmación de la integridad de las vesículas y su contenido.
- Reduce el riesgo de avanzar preparaciones de exosomas mal caracterizados hacia estudios preclínicos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este protocolo de imagen de exosomas basado en microscopía electrónica de transmisión se enmarca dentro del continuo desde el descubrimiento inicial hasta la fase preclínica, proporcionando datos fundamentales para la validación de dianas y la preparación de ensayos.
- Biología del Descubrimiento: Confirma la estructura de los exosomas y su contenido biomolecular, apoyando la formulación de hipótesis y la aclaración de vías.
- Cribado: Proporciona resultados de imagen cuantitativos y reproducibles para la estandarización de ensayos.
- Análisis: Permite la medición del tamaño, la morfología y la intensidad de tinción de los exosomas para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Facilita la alineación con estrategias de biomarcadores cuando se utilizan exosomas como indicadores traducibles.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo de imagen estandarizado aplicable en múltiples programas de descubrimiento.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la investigación de exosomas.
- Valor operativo: Proporciona resultados de imagen estandarizados y reproducibles para permitir comparaciones entre equipos.
- Valor estratégico: Apoya decisiones informadas de avance o interrupción y el avance eficiente en términos de capital de programas basados en exosomas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo al proporcionar datos estructurales sólidos desde las primeras etapas del proceso.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en ultramicrotomía, tinción y operación de microscopía electrónica de transmisión (TEM).
- Exige acceso a instrumentación avanzada de microscopía e infraestructura analítica.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de corte y tinción.
- Puede requerir adaptaciones para diferentes fuentes de exosomas o sistemas modelo.
- La preparación de la muestra y la duración de la tinción deben optimizarse para obtener una calidad de imagen consistente.
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Última actualización: 22 agosto 2026