Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Investigación sobre el cáncer
0 visualizaciones • 3:26 min. • April 30th, 2023
Para detectar una secuencia de ARN específica en una célula, comience tomando una sección de tejido en un portaobjetos de vidrio. Superponga la sección de tejido con un tampón de hibridación adecuado que contenga las sondas de ARN diana.
Estas sondas son moléculas de ARN en forma de Z que tienen una porción de reconocimiento de objetivos en un extremo y una secuencia de cola en el otro extremo. Un brazo espaciador une estos dos extremos.
Ahora, incube el portaobjetos en un horno de hibridación a una temperatura óptima. Las sondas de ARN en forma de Z ingresan a la célula y se hibridan con la secuencia de ARNm objetivo correspondiente en pares.
Retire el portaobjetos del horno. Sumerja el portaobjetos en una solución de lavado para eliminar las sondas sueltas y el exceso de tampón de hibridación.
A continuación, agregue una solución de preamplificador e incube. La molécula preamplificadora se une a la secuencia de cola de dos sondas Z adyacentes. Esta molécula no se une a una sola sonda Z, lo que garantiza la especificidad.
A continuación, agregue la mezcla de reactivos amplificadores e incube. Múltiples moléculas amplificadoras se hibridan en la secuencia de preamplificador única.
Finalmente, etiquete la sección de tejido con las sondas de etiquetado deseadas para detectar la presencia de una secuencia de ARN específica en la célula.
Para iniciar la hibridación, toque y mueva los portaobjetos para eliminar el exceso de líquido y volver a colocarlos en la rejilla para portaobjetos. Retire la sonda de VPH precalentada del horno y agregue aproximadamente cuatro gotas para cubrir completamente cada sección. Cubre la bandeja con una tapa e introdúcela en el horno durante 2 horas a 40 grados centígrados. Después de completar la incubación, retire la bandeja del horno y retire la rejilla para portaobjetos.
Un portaobjetos a la vez, elimine rápidamente cualquier exceso de líquido y coloque el portaobjetos en una rejilla para portaobjetos sumergida en un plato de tinción lleno de 1x tampón de lavado, lave los portaobjetos durante 2 minutos a temperatura ambiente con agitación constante, y repita con 1x tampón de lavado fresco. Toque y mueva para eliminar el exceso de líquido de los portaobjetos y colóquelos nuevamente en la rejilla de portaobjetos. Agregue aproximadamente cuatro gotas de AMP1 a temperatura ambiente por sección para cubrir completamente cada sección. Cubre la bandeja con una tapa e introdúcela en el horno durante 30 minutos a 40 grados centígrados.
Después de sacar la bandeja del horno, retire la rejilla deslizante. Trabajando un portaobjetos a la vez, elimine rápidamente cualquier exceso de líquido y coloque el portaobjetos en la rejilla de portaobjetos sumergido en un plato de tinción lleno de 1x tampón de lavado, lave durante 2 minutos a temperatura ambiente con agitación constante y repita con 1x tampón de lavado fresco.