Detección de señales de ARN CISH: una técnica para detectar señales cromogénicas durante la hibridación in situ de ARN en muestras de tejido intacto

Para detectar señales cromogénicas durante la hibridación de ARN, comience tomando una sección de tejido en un portaobjetos de vidrio. Esta sección contiene ARN diana, prehibridado con una sonda de ARN marcada con peroxidasa de rábano picante.

Dispense unas gotas de diaminobenzidina o DAB, un sustrato de detección, sobre la sección de tejido e incube.

El DAB ingresa a la célula y la enzima peroxidasa de rábano picante la oxida para formar un precipitado marrón. Esta reacción imparte un color marrón a secuencias específicas de ARN en la célula. Las células que no contienen ARN diana no tendrán actividad peroxidasa y permanecerán sin teñir.

A continuación, contratiñe la sección de tejido con hematoxilina. La hematoxilina se une al ADN e imparte una tinción púrpura a la sección de tejido.

Trate la sección de tejido con agua de amoníaco, una solución azulada. Reduce la intensidad de la tinción púrpura, haciendo que las células parezcan azules. Este paso es esencial para una visualización clara de las manchas marrones dentro de las células.

Ahora, sumerja la sección de tejido en concentraciones crecientes de etanol y luego trátela con xileno, un solvente orgánico. Estos pasos deshidratan la sección de tejido para obtener mejores imágenes.

Finalmente, selle el portaobjetos con una solución de montaje y un cubreobjetos y visualícelo bajo un microscopio óptico. Las células exhiben puntos marrones punteados que indican la presencia de ARN diana.

Dispense la misma cantidad de gotas de cada solución DAB-A y DAB-B en un tubo del tamaño adecuado para producir aproximadamente 120 microlitros de sustrato DAB por sección y vórtice. Tome cada portaobjetos, uno a la vez, de la rejilla de portaobjetos y toque y mueva para eliminar el exceso de líquido, y vuelva a colocarlo en el portaobjetos. Pipetea aproximadamente 120 microlitros de mezcla DAB en cada sección de tejido, asegurándote de que las secciones estén cubiertas. Incube durante 10 minutos a temperatura ambiente y proceda con la contratinción.

Coloque una gota de medio de montaje por listón de vidrio y luego coloque el listón en los portaobjetos y déjelos secar al aire. Después de unas horas, proceda con la evaluación utilizando un microscopio óptico como se describe en el manuscrito.

• Chromogenic In Situ Hybridization (CISH) - Technique for detecting RNA or DNA sequences.
• Diaminobenzidine (DAB) - Detection substrate used in CISH testing.
• Horseradish Peroxidase - Enzyme that oxidizes DAB during RNA hybridization.
• Hematoxylin - Stain that binds to DNA during CISH technique.
• Chromogenic Materials - Substances that produce a colour when exposed to radiation.

• Introduce CISH - It's a molecular technique for detecting specific sequences of DNA or RNA (e.g., CISH testing).
• Key Concepts - Horseradish peroxidase oxidizes DAB to create a signal (e.g., CISH technique).
• Underlying Mechanisms - Staining and de-staining processes reveal target RNA (e.g., CISH staining).
• Connect to Experiment - Signals seen under microscope confirm presence of target RNA.

• What is CISH and how does it enable RNA and DNA detection?
• How does the oxidation of DAB works in the CISH technique?
• Why is the staining and de-staining process critical for the CISH procedure?

• Practical Applications - CISH testing aids in disease diagnostics (e.g., biomedical research).
• Industry Impact - Developments in diagnostic techniques (e.g., healthcare).
• Societal Importance - Improves disease detection rates (e.g., public health).
• Link to Scientific Advancements - Continued innovation in chromogenic materials and techniques.