JoVE Encyclopedia of Experiments
Investigación sobre el cáncer
0 vistas • 2:59 min • April 30th, 2023
Los esferoides son agregados celulares esféricos tridimensionales in vitro que imitan el microambiente tumoral in vivo y ayudan a estudiar la progresión tumoral. Para preservar estos esferoides mediante la inclusión, comience tomando un tubo estéril que contenga esferoides en un tampón deseado.
Trate los esferoides con paraformaldehído. El paraformaldehído reticula las proteínas celulares, lo que resulta en la estabilización y preservación de la estructura celular. Centrifugar los esferoides y eliminar el sobrenadante que contiene paraformaldehído. Vuelva a suspender el sedimento esferoide en tampón.
A continuación, prepare la concentración deseada de solución de gel de agarosa fundida. Haga una gota de gel de agarosa en un portaobjetos de microscopio. Mantenga la corredera sobre un bloque calefactor para evitar la solidificación de la agarosa.
Con una micropipeta con una punta de orificio ancha, recoja los esferoides del tubo. Pipetea con cuidado los esferoides en el centro de la gota de gel de agarosa sin tocar el portaobjetos del microscopio. Posteriormente, incube el portaobjetos a una temperatura adecuada para permitir que la ECM se solidifique y atrape los esferoides en su interior.
Transfiera suavemente la gota semisólida del portaobjetos del microscopio a un casete de tejido. Almacene los esferoides incrustados en etanol hasta un análisis posterior.
Para comenzar, fije los esferoides en una campana extractora el primer día como se describe en el protocolo de texto. El segundo día, coloque el gel de agarosa en un vaso de precipitados lleno de agua en un horno de microondas para calentarlo y mantenga el gel caliente en una placa calefactora de sobremesa a 60 grados centígrados hasta que lo necesite.
Lave los esferoides dos veces en la campana extractora con 1 mililitro de PBS helado 1X por lavado. Luego, aspire la mayor parte del PBS. Prepare una punta de pipeta de 20 microlitros cortándola en una inclinación para obtener una punta más puntiaguda con un orificio más grande.
Después de esto, haga una gota de gel de agarosa en un portaobjetos de microscopio. Coloque el portaobjetos en un bloque calefactor tibio para evitar que la agarosa se solidifique. Con la punta de pipeta modificada, atrape tantos esferoides como sea posible en un volumen de 15 a 20 microlitros.
Inyecte con cuidado los esferoides en el centro de la gota de gel de agarosa, asegurándose de no tocar el portaobjetos del microscopio. Incube a temperatura ambiente o a 4 grados durante 5 a 10 minutos para que el gel de agarosa se endurezca. Cuando la gota de gel se haya solidificado un poco pero aún esté bastante blanda, use un bisturí para empujarla con cuidado desde el portaobjetos del microscopio a un casete de tejido de plástico. Transfiera el casete de tejido a un vaso de precipitados lleno de etanol y guárdelo a temperatura ambiente.