Fabricación de matriz extracelular a partir de un modelo de ratón: un procedimiento eficaz para preparar la matriz extracelular de la lengua descelularizada a partir de la lengua murina

La matriz extracelular o ECM, el componente no celular del entorno tisular, consiste en una red compleja de proteínas estructurales y reguladoras y polisacáridos secretados por las células. La ECM proporciona soporte estructural y bioquímico a las células y regula su crecimiento.

Para preparar la matriz extracelular de la lengua, comience tomando una lengua de ratón recién cosechada. Lávelo con etanol para eliminar su capa lipídica.

A continuación, somételo a ciclos alternos de congelación y descongelación. La congelación promueve la formación de cristales de hielo intracelulares, mientras que la descongelación derrite los cristales de hielo, lo que resulta en la ruptura de la membrana celular.

Ahora, suspenda la lengua en una solución antibiótica para inhibir el crecimiento bacteriano. Posteriormente, tratar el órgano con una solución salina hipertónica. En presencia de una alta concentración de soluto, el agua fluye de las células, lo que hace que se encojan. Este paso ayuda en la muerte celular y el desprendimiento de la matriz extracelular.

Incube la lengua en un tensioactivo no iónico. El tensioactivo solubiliza completamente las membranas celulares y nucleares, facilitando la liberación de contenidos intracelulares en la solución.

Por último, suspenda la lengua en una solución que contenga iones de calcio y magnesio, seguida de un tratamiento con nucleasas. Los iones de calcio y magnesio mejoran la actividad de las nucleasas para degradar los ácidos nucleicos libres en la solución.

Almacene el tejido de la lengua descelularizado en un tampón adecuado hasta su posterior procesamiento.

Después de aislar las lenguas de ratones sacrificados de acuerdo con el protocolo de texto, sumerja el tejido en etanol al 75% durante 3 minutos. Luego, transfiera cada lengua a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con 1 mililitro de PBS estéril de 10 milimolares. Para llevar a cabo la lisis celular, congele las lenguas a menos 80 grados centígrados durante 1 hora. Luego, descongele el tejido a temperatura ambiente durante 45 minutos. Repita la congelación y descongelación dos veces más.

Luego, en una placa de cultivo de 3,5 o 6 centímetros que contenga etanol al 75%, use una aguja quirúrgica para cargar cada lengua en un trozo de sutura quirúrgica y, con un pequeño trozo de papel de aluminio estéril, envuelva el extremo de la sutura. En una placa de cultivo de 3,5 o 6 centímetros, use 3 mililitros de PBS para enjuagar cada lengua durante 30 segundos. Luego, en una botella de boca ancha, prepare 90 microgramos por mililitro de ampicilina en 250 mililitros de agua ultrapura estéril y agregue una barra de agitación.

Baje hasta 5 lenguas dentro de la botella hasta que estén aproximadamente a 2 centímetros del fondo y apriete la tapa con parte de la sutura restante fuera de la botella. Coloque la botella en un agitador magnético durante 12 horas. Luego, después de la incubación, prepare 250 mililitros de 90 microgramos por mililitro de ampicilina en cloruro de sodio estéril de 1 molar. Transfiera las lenguas y la barra de agitación a la botella y enrosque la tapa. Coloque la botella en el agitador magnético durante 24 horas.

Para llevar a cabo la lisis celular, prepare 90 microgramos por mililitro de ampicilina en 250 mililitros de Tritón X-100 estéril al 2% en PBS. Transfiera las lenguas y la barra de agitación a la botella y apriete la tapa. Luego, revuelva la botella durante 48 horas. Después de preparar cloruro de calcio y cloruro de magnesio con ampicilina, mueva el pañuelo y la barra de agitación dentro de la botella y revuelva la botella durante 24 horas.

Prepare 1 mililitro de 300 DNasa micromolar en HBSS en un tubo de microcentrífuga para cada muestra de lengua. Transfiera las lenguas a los tubos con la misma porción de sutura colgando afuera. Luego, incube el tejido a 37 grados centígrados durante 24 horas. Transfiera las muestras nuevamente a una botella de boca ancha de PBS estéril con ampicilina y colóquela en el agitador durante 24 horas. Después de la incubación, almacene la matriz extracelular de la lengua preparada, o TEM, en PBS estéril a 4 grados centígrados hasta su uso.