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Investigación sobre el cáncer
0 vistas • 5:22 min • April 30th, 2023
Un tumor contiene una pequeña fracción de células madre conocidas como población lateral. Estas células son quimiorresistentes, lo que las hace responsables de la recaída del cáncer.
Para aislar la población lateral de células cancerosas, comience agregando Hoechst, una solución de tinte fluorescente, al vial que contiene la suspensión de células cancerosas. Dentro de las células cancerosas normales, las moléculas de Hoechst ingresan al núcleo y se unen a la región rica en A-T en el ADN, lo que lleva a una alta fluorescencia en estas células.
Por el contrario, la población lateral contiene una alta concentración de transportadores ABC, bombas de eflujo que eliminan rápidamente las moléculas de tinte de la célula. Esta salida activa de moléculas de colorante hace que la población lateral sea fluorescente a baja intensidad.
Ahora, tome otro vial de células cancerosas tratadas con Hoechst y agréguele verapamilo. Este vial actúa como control ya que Verapamil bloquea los transportadores ABC. Este paso provoca una reducción en el flujo de salida de Hoechst y retiene el tinte dentro de las células de la población lateral.
A continuación, contratiñe las células en ambos viales con yoduro de propidio. El yoduro de propidio entra exclusivamente en el núcleo de las células muertas y se intercala entre las bases del ADN. Esto conduce a una alta fluorescencia en las células muertas.
Finalmente, clasifique las células usando un clasificador de células activado por fluorescencia o FACS. FACS separa las células tumorales altamente fluorescentes que retienen Hoechst y las células muertas de las células de población lateral de baja fluorescencia.
Para seleccionar una población lateral de células madre cancerosas mediante el ensayo de salida de colorante de Hoechst, primero, etiquete un tubo cónico como "Hoechst" y otro como "Hoechst y verapamilo". A continuación, lave un cultivo de células HNSCC con PBS estéril, seguido de la adición de 1 mililitro de tripsina-EDTA. Después de 3 minutos a 37 grados centígrados, detenga la reacción con medio de cultivo celular fresco y cuente las células. Diluir el cultivo a 1 por 10 a la séptima célula por mililitro en medio de línea celular parental completa.
Luego, agregue 100 microlitros al tubo "Hoechst y Verapamilo" y 4 mililitros de células al tubo "Hoechst". A continuación, mezcle suavemente 10 microlitros de solución de clorhidrato de verapamilo de 5 milimolares en la muestra "Hoechst y verapamilo", seguido de 5 microlitros de Hoechst por 1 por 10 a las sextas celdas de ambos tubos. Luego, cubra las muestras con papel de aluminio y colóquelas a 37 grados centígrados. Después de 90 minutos con una mezcla suave cada 15 minutos, centrifugar los tubos y volver a suspender los gránulos en 2 mililitros de PBS.
Después de una segunda centrifugación, resuspender el pellet "Hoechst y Verapamilo" en 500 microlitros de yoduro de propidio en PBS y el pellet "Hoechst" en 4 mililitros del mismo. Ahora, filtre las muestras a través de filtros celulares de 70 micras en tubos FACS para eliminar cualquier agregado y coloque las muestras en hielo protegido de la luz. A continuación, cargue la muestra "Hoechst" en el citómetro de flujo y abra la ventana "Hoja de trabajo global" en el software del citómetro de flujo. Haga clic en "Diagrama de puntos" para crear un gráfico en la hoja de trabajo global y haga clic derecho para seleccionar los parámetros de dispersión frontal y lateral.
Cree un diagrama de puntos de dispersión lateral ancho por una altura de dispersión lateral de la misma manera y luego haga clic en "Puerta de polígono" para crear una región P1 en el segundo gráfico para seleccionar las celdas individuales y discriminar los dobletes. A continuación, cree un área roja de Hoechst con un diagrama de puntos de área azul de Hoechst y haga clic derecho en las celdas para resaltar la población P1. Luego, cree una región P2 para seleccionar la población de células del lado del colorante Hoechst negativo que aparece como un brazo lateral a la izquierda de la población principal de células y recolecte 10,000 de los eventos de muestra "Hoechst".
Para confirmar que la puerta P2 que representa la población lateral está colocada correctamente, recopile también 10,000 eventos de muestra "Hoechst y Verapamil". La población lateral debería desaparecer. Luego, clasifique la población lateral de células negativas colorantes de Hoechst en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 1 mililitro de medio completo de células madre cancerosas. Al final del tipo, gire las células hacia abajo y vuelva a suspender el gránulo de población lateral en 1 mililitro de medio de células madre cancerosas completas frescas. Luego, cuente las células y siembre en el número apropiado en un nuevo matraz de cultivo celular.