Extracción de exosomas basada en perlas magnéticas: una técnica para aislar exosomas específicos de biofluidos

Los exosomas son estructuras vesiculares extracelulares secretadas por las células en biofluidos. Para capturar exosomas específicos de biofluidos, comience tomando perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina en un tubo.

A este tubo, agregue anticuerpos antihumanos biotinilados. La biotina presente en los anticuerpos tiene una alta afinidad por la estreptavidina presente en las perlas magnéticas. Esto da como resultado la conjugación de los anticuerpos con las perlas magnéticas.

A continuación, agregue una solución de bloqueo rica en proteínas al tubo que contiene las perlas magnéticas marcadas con anticuerpos. Las proteínas de la solución bloqueadora se unen a los sitios libres de las perlas magnéticas y aumentan la especificidad de la unión de los exosomas.

Ahora, complemente el tubo con una muestra de biofluido rico en exosomas. Incube el tubo con agitación. Los exosomas en el biofluido muestran receptores de superficie específicos, que les ayudan a unirse a los anticuerpos adheridos a la superficie de las perlas magnéticas.

A continuación, coloque el tubo en un campo magnético. Bajo la influencia del campo magnético, las perlas magnéticas unidas al exosoma se adhieren a la superficie del tubo. Luego, usando una micropipeta, aspire el biofluido restante del tubo.

Finalmente, retire el tubo del campo magnético y agregue un tampón adecuado para eluir las perlas unidas al exosoma. Estas perlas unidas a exosomas se pueden utilizar para un análisis posterior posterior.

Vuelva a suspender una solución madre que contenga 10 microgramos por mililitro de micropartículas magnéticas recubiertas de estreptavidina y agregue 5 microlitros de la solución a un tubo de microcentrífuga que contenga 495 microlitros de PBS. Para lavar las perlas, primero, coloque el tubo en una rejilla magnética durante 1 minuto y retire con cuidado el tampón sin alterar las perlas.

Luego, transfiera el tubo a una gradilla no magnética. Agregue 500 microlitros de PBS y pipeta para lavar las perlas. Haga esto un total de tres veces. Después del lavado final, vuelva a suspender las perlas en 490 microlitros de PBS y luego agregue 5 microlitros de anticuerpo CD63 antihumano de ratón biotinilado de una solución madre de 1 miligramo por mililitro.

Mezclar la solución pipeteando. Programe un rotador de muestra para rotación recíproca a 90 grados durante 5 segundos y vibración a 5 grados durante 1 segundo. Coloque los tubos en el rotador y ejecute el programa durante 30 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, transfiera los tubos a la gradilla magnética durante 5 minutos. Lave las perlas tres veces con 500 microlitros de PBS y luego vuelva a suspenderlas en 490 microlitros de PBS que contengan caseína. Etiquete un tubo con la identificación de la muestra y luego agregue 10 microlitros de la muestra.

Pipetear varias veces para mezclar la muestra con las perlas conjugadas con anticuerpos. A continuación, transfiera los tubos al rotador de muestras y ejecute el mismo programa durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuación, lave las perlas tres veces con 500 microlitros de un tampón de clorhidrato de Tris de 1 M utilizando la rejilla magnetizada. Los exosomas ahora están unidos a las perlas magnetizadas.