Cultivo de salisferas a partir de tejido de glándulas salivales: un método para desarrollar salisferas a partir de células epiteliales derivadas de glándulas salivales humanas

Los salispheres son cultivos in vitro, autoagregados, de células epiteliales derivadas de la glándula salival. Para cultivar salisferas, comience tomando el tejido de la glándula salival humana en una placa de cultivo.

Con unas tijeras, pica el tejido en trozos finos. A continuación, complemente estas piezas con una solución de disociación que contenga enzimas colagenasa y dispasa e incube. Estas enzimas digieren la matriz extracelular presente en el tejido.

Además, triture para homogeneizar el tejido. Este paso libera las células epiteliales y los glóbulos rojos en la solución. A continuación, use un colador celular y filtre el homogeneizado de tejido en un tubo cónico nuevo para eliminar los trozos de tejido no digeridos y los desechos. Centrifugar para peletizar las células.

Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular en el tampón de lisis de glóbulos rojos. Este tampón rompe los glóbulos rojos presentes en la suspensión celular.

Ahora, centrifugar para peletizar las células epiteliales. Vuelva a suspender el gránulo en un medio de crecimiento de células epiteliales apropiado. Además, prepare la placa de cultivo de salisphere recubriendo su pocillo con una matriz de membrana basal licuada o BMM. Incubar para permitir que la matriz se solidifique.

Finalmente, agregue la suspensión de células epiteliales en los pocillos recubiertos de BMM. En presencia de medios de crecimiento, las células epiteliales se adhieren a la capa BMM y proliferan en salisferas esféricas.

Dentro de las dos a cuatro horas posteriores a la extracción del paciente, en una placa de cultivo, use tijeras de disección esterilizadas en autoclave y fórceps quirúrgicos para picar el tejido de la glándula salival en trozos finos del tamaño de 1 a 2 milímetros. Agregue 6 mililitros de la solución de dispasa / colagenasa al tejido picado. Luego, incube a 37 grados centígrados durante aproximadamente 30 minutos a una hora.

Altere el tejido pipeteando con la pipeta serológica de 5 mililitros, de 15 a 20 veces. Incube a 37 grados centígrados durante otros 30 minutos a una hora. Repita el paso de pipeteo e incubación dos o tres veces más o hasta que el tejido se asemeje a una suspensión y pueda pasar fácilmente a través de la abertura de la pipeta.

Para recubrir los pocillos con BMM, pipetee lentamente 500 microlitros de BMM descongelado durante la noche en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Gire lentamente la placa para distribuir uniformemente el BMM sobre los pocillos. Luego, incube las placas recubiertas a 37 grados Celsius durante al menos 15 minutos antes de usarlas para permitir que el BMM se solidifique.

Transfiera la solución de dispasa/colagenasa que contiene tejido homogeneizado a un tubo cónico de 15 milímetros. Lave la pared de la placa una vez con 6 mililitros de DPBS para transferir las células restantes al tubo cónico. Luego, a través de un colador celular de malla de nailon de 70 micrómetros, filtre el homogeneizado en un nuevo tubo cónico de 50 milímetros para eliminar el tejido no digerido.

Centrifugar las células coladas durante 5 minutos a 500 x g. Aspirar el sobrenadante. Luego, vuelva a suspender el sedimento celular en 10 mililitros de 1x tampón de lisis de glóbulos rojos. Incubar durante 5 minutos a 37 grados centígrados. Luego, agregue de 20 a 25 milímetros de DPBS para neutralizar el tampón de lisis de glóbulos rojos y minimizar la lisis de las células salivales.

Centrifugar durante 5 minutos a 500 x g. El gránulo de glóbulos blancos indica la lisis completa de todos los glóbulos rojos. Si el gránulo tiene color rojo, repita el tratamiento con tampón de lisis de glóbulos rojos. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en 1 a 2 mililitros de BEGM y luego transfiera las células resuspendidas a pocillos recubiertos de BMM.

Incubar a 37 grados centígrados. Una vez sembradas en BMM, las células se formarán en estructuras esféricas o salisferas durante un período de dos a tres días. Las células se pueden mantener como salisferas durante aproximadamente cinco a siete días antes de que el BMM comience a degradarse, lo que permite que las células accedan y se adhieran al plástico y crezcan como una monocapa.