Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Investigación sobre el cáncer
0 visualizaciones • 3:05 min. • April 30th, 2023
Para aislar y purificar núcleos intactos, comience tomando una fracción de núcleos crudos en un tubo. La fracción contiene núcleos intactos junto con fragmentos de núcleos rotos y escombros.
Mezcle esta fracción con un medio de gradiente de densidad adecuado de modo que forme una suspensión de la concentración más baja.
Ahora, coloque soluciones de densidades crecientes del mismo medio de gradiente debajo de la fracción de núcleos crudos preparados previamente para generar un gradiente de densidad discontinuo de varios pasos. Este paso permite que la fracción de núcleos crudos forme una banda en la parte superior del gradiente.
A continuación, centrifuga el tubo a baja velocidad.
Según las diferencias en forma y masa, los núcleos intactos migran de manera diferente en comparación con los escombros y los fragmentos nucleares. Esto da como resultado núcleos intactos que forman una banda separada.
Después de la centrifugación, ubique la banda distintiva que consta de núcleos intactos en la interfaz de las soluciones de gradiente de densidad.
Con una pipeta, aspire las capas superiores del gradiente para facilitar el acceso a la banda de núcleos puros. Recoja la banda que contiene los núcleos en un tubo nuevo.
Visualiza estos núcleos bajo un microscopio óptico. Los núcleos intactos parecen perfectamente redondos con una membrana nuclear intacta que los rodea.
Finalmente, almacene la fracción nuclear pura para su posterior análisis.
Agregue 200 microlitros de solución de yodixanol al 50% a los núcleos para obtener una concentración final de yodixanol al 25% y mezcle 10 veces con la pipeta ajustada a 300 microlitros.
Luego, agregue 300 microlitros de solución de yodixanol al 29% debajo de la mezcla al 25% usando una punta fina P1000 para evitar mezclar las capas. Agregue 300 microlitros de solución de yodixanol al 35% debajo de la mezcla al 29% con una punta fina P1000. Luego, retíralo lentamente.
Coloque las muestras en una centrífuga de cubo oscilante y gírelas durante 20 minutos a 3.500 x g a 4 grados centígrados con el freno apagado.
Retire suavemente las muestras sin agitarlas y obsérvelas bajo la luz. Una banda blanca clara de núcleos puros al 95% debe ser visible entre la segunda y la tercera capa.
Para aislar los núcleos, aspire las capas superiores para exponer la banda blanca de los núcleos en la interfaz. Recoja la banda de núcleos en un volumen de 200 mililitros y transfiérala a un tubo nuevo. Luego, fíltrelo con un filtro de 20 micrómetros.
Revise los núcleos bajo un microscopio óptico para verificar la eliminación de desechos grandes y la integridad de la membrana nuclear. Deben ser redondos y la membrana nuclear no debe distorsionarse.