Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Investigación sobre el cáncer
0 visualizaciones • 4:00 min. • April 30th, 2023
La ubiquitinación de proteínas se caracteriza por la adición de ubiquitina, una miniproteína reguladora, a través de sus residuos de diglicina a los residuos de lisina de la proteína sustrato. Esto genera un enlace lisina-glicina-glicina entre la proteína sustrato y la ubiquitina.
Para aislar los péptidos marcados con ubiquitina, comience tomando una mezcla de péptidos.
Trate estos péptidos con un cóctel de enzimas endonucleasas. Durante el tratamiento, las enzimas Lys-C y tripsina escinden eficientemente los péptidos ubiquitinilados en el residuo de arginina, lo que da como resultado fragmentos de péptidos que contienen un motivo característico de diglicina.
Agregue estos fragmentos de péptidos a una suspensión de perlas de hidrogel conjugadas con anticuerpos.
Estos anticuerpos contienen un sitio de reconocimiento de diglicina, que se une exclusivamente a los péptidos ubiquitinilados, formando un complejo péptido-perla.
Centrífuga para peletizar complejos de perlas de péptidos ubiquitinilados. Retire el sobrenadante no unido que contiene péptidos no ubiquitinilados.
Cargue los complejos en un conjunto de filtros. Centrifugar para eliminar el tampón y atrapar las perlas conjugadas con péptidos.
Agregue un reactivo acidificado que reduzca el pH, lo que provoca la desconexión de los péptidos de las perlas.
Recuperar los péptidos libres del filtrado. Cárguelos en un filtro nuevo con una matriz hidrofóbica. Los péptidos se retienen en la matriz mientras que las sales ácidas se eliminan.
Con un disolvente adecuado, separe los péptidos.
Transfiera los péptidos ubiquitinilados a un tubo nuevo y séquelos para eliminar cualquier rastro de solvente.
Un lote de anticuerpos con motivos remanentes de ubiquitina conjugados con una suspensión de perlas de agarosa de proteína A se divide en seis fracciones iguales. Disuelva las tres fracciones peptídicas de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y gire los escombros.
Agregue los sobrenadantes de las tres fracciones a la suspensión de perlas mientras mantiene las otras tres fracciones en hielo e incube durante 2 horas a 4 grados centígrados en una unidad rotatoria.
Luego, gira las cuentas. Transfiera el sobrenadante a un nuevo lote de perlas y repita la incubación con las tres fracciones de lechada de perlas restantes.
Almacene los sobrenadantes para su posterior análisis global del proteoma y transfiera las perlas a puntas de pipeta de 200 microlitros equipadas con un tapón de filtro GF/F.
Coloque las puntas en tubos de 1,5 mililitros equipados con un adaptador de punta de centrífuga y lave las perlas tres veces con 200 microlitros de tampón IAP helado, seguido de tres lavados con agua purificada helada.
Gire las columnas a 200 x g durante 2 minutos entre lavados, asegurándose de no dejar que la columna se seque. Después del lavado final, eluya los péptidos con dos ciclos de 50 microlitros de TFA al 0,15%. Desalar los péptidos con una punta de etapa C18 y secarlos con centrifugación al vacío.