Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Investigación sobre el cáncer
0 visualizaciones • 4:00 min. • April 30th, 2023
La ubiquitinación de proteínas se caracteriza por la adición de ubiquitina, una miniproteína reguladora, a través de sus residuos de diglicina a los residuos de lisina de la proteína sustrato. Esto genera un enlace lisina-glicina-glicina entre la proteína sustrato y la ubiquitina.
Para aislar los péptidos marcados con ubiquitina, comience tomando una mezcla de péptidos.
Trate estos péptidos con un cóctel de enzimas endonucleasas. Durante el tratamiento, las enzimas Lys-C y tripsina escinden eficientemente los péptidos ubiquitinilados en el residuo de arginina, lo que da como resultado fragmentos de péptidos que contienen un motivo característico de diglicina.
Agregue estos fragmentos de péptidos a una suspensión de perlas de hidrogel conjugadas con anticuerpos.
Estos anticuerpos contienen un sitio de reconocimiento de diglicina, que se une exclusivamente a los péptidos ubiquitinilados, formando un complejo péptido-perla.
Centrífuga para peletizar complejos de perlas de péptidos ubiquitinilados. Retire el sobrenadante no unido que contiene péptidos no ubiquitinilados.
Cargue los complejos en un conjunto de filtros. Centrifugar para eliminar el tampón y atrapar las perlas conjugadas
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