Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Investigación sobre el cáncer
0 visualizaciones • 3:22 min. • April 30th, 2023
Para comenzar, tome un tubo que contenga vesículas extracelulares intactas o EV.
Suspenda los EV en el volumen deseado de tampón de lisis y sonique la muestra. Este tratamiento lisa la membrana EV y corta el material genético, liberando las proteínas en el tampón.
Centrífuga para peletizar los restos celulares y el material genético cortado. Recoge el sobrenadante que contiene varias proteínas.
Agregue un colorante de carga al extracto de proteína y ejecútelo en un gel SDS-PAGE.
Remoje el gel en una solución de tinción para permitir que las moléculas de tinte se unan a las proteínas. Localice la banda teñida que contiene la proteína deseada y elimínela.
Corta la banda de color en trozos pequeños para mejorar la accesibilidad de las proteínas a las enzimas en los pasos posteriores. Transfiera estas piezas a un tubo de microcentrífuga.
Agregue una solución decolorante que elimine el tinte de tinción. Retire la solución decolorante gastada.
Agregue una solución de reducción. Incubar para permitir que el agente reductor escinda los enlaces disulfuro en la proteína, exponiendo los grupos sulfhidrilo libres.
Trate las proteínas reducidas con una solución alquilante. Los grupos alquilo se unen a los grupos sulfhidrilo libres, manteniendo la proteína desplegada.
Deseche el exceso de solución y lave las piezas con una solución deshidratante para eliminar el reactivo alquilante. Seca el gel por completo.
Las piezas de gel ahora están listas para un análisis proteómico adicional.
Para la extracción de proteínas, mezcle 50 microlitros de tampón RIPA con la muestra EV durante 5 minutos en hielo. Sonicar la muestra tres veces a 500 vatios y 20 kilohercios durante 5 segundos. Luego, elimine los desechos vesiculares centrifugando a 20,000 x g durante 10 minutos a 4 grados centígrados.
Después de aislar las proteínas, realice la migración de proteínas en el gel de apilamiento de un gel de poliacrilamida al 12%. Fije las proteínas en el gel con azul de Coomassie durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego, extirpe cada pieza de gel de color y córtela en trozos pequeños.
Ponga las piezas de gel a través de una serie de lavados sucesivos como se describe en el manuscrito. Luego, séquelos completamente con un concentrador de vacío. Después del secado, realice la reducción de proteínas con 100 microlitros de bicarbonato de amonio de 100 milimolares que contengan ditiotreitol de 10 milimolares durante 1 hora a 56 grados centígrados.
A continuación, realice la alquilación de proteínas con 100 microlitros de bicarbonato de amonio de 100 milimolares que contengan yodoacetamida de 50 milimolares durante 45 minutos en la oscuridad. Lave las piezas de gel de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y séquelas completamente en el concentrador de vacío.