Ensayo de atracción de macrófagos transpocillos basado en fluorescencia: un método in vitro para estudiar la interacción tumor-macrófago a través de la quimiotaxis inducida químicamente

En respuesta a ciertos atrayentes químicos liberados por tumores sólidos, las células inmunitarias como los macrófagos asociados a tumores o TAM se infiltran en los tumores sólidos. Posteriormente, estos TAM facilitan la progresión tumoral.

Para estudiar las interacciones entre los TAM y las células tumorales in vitro, comience tomando una placa de pocillos múltiples con un inserto membranoso. Esta disposición separa temporalmente el pozo en dos compartimentos.

A continuación, agregue una suspensión de TAM al compartimento superior del transwell.

Complemente el compartimento inferior del transpozo con un medio acondicionado enriquecido con atrayentes químicos secretados por las células tumorales.

Incube la placa durante el tiempo deseado.

Durante la incubación, los moduladores químicos atraen a los TAM. Esto conduce al movimiento de TAM hacia el compartimento inferior a través de la membrana de inserción porosa a través de la quimiotaxis inducida por productos químicos.

Ahora, retire el inserto del pozo. Transfiera el medio acondicionado que contiene la población TAM migrante a una placa adecuada para la medición fluorescente.

Trate las células con un tampón de lisis que contenga un tinte fluorescente. Este tampón lisa los macrófagos. Eventualmente, las moléculas de tinte se unen a los ácidos nucleicos, produciendo una fluorescencia mejorada.

Finalmente, escanee la placa con un lector de placas de fluorescencia. Una alta fluorescencia indica la migración exitosa de macrófagos a través de la quimiotaxis inducida por productos químicos.

Primero, lleve los materiales necesarios a temperatura ambiente. Agregue 250 microlitros de las celdas MV-4-11 preparadas a cada inserto. A continuación, agregue 400 microlitros del medio acondicionado/medio solo a las cámaras inferiores de la placa de 24 pocillos, asegurándose de agregar las muestras por triplicado.

Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante 4 horas. Luego, golpee suavemente el inserto en la pared interior del mismo pozo y deseche el inserto. Pipetea suavemente las células de los pocillos hacia arriba y hacia abajo tres veces para mezclar.

Transfiera 225 microlitros de esta suspensión celular a los pocillos de una placa de 96 pocillos de paredes negras adecuada para la medición fluorescente. Después de esto, diluya el colorante CyQuant con tampón de lisis 4x en una proporción de 1:75. Agite brevemente y gire la solución.

Transfiera 75 microlitros de esta solución a cada pocillo de la placa de 96 pocillos e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Usando un lector de placas de fluorescencia, lea la fluorescencia y analice los datos como se describe en el protocolo de texto.