Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Investigación sobre el cáncer
0 visualizaciones • 2:54 min. • April 30th, 2023
Comience tomando una placa de pocillos múltiples que contenga células adherentes.
Trate estas células con un medio que contenga timidina tritiada, una versión radiactiva de la timidina, e incube.
Durante la incubación, las células que se replican activamente incorporan timidina radiactiva. Esta timidina se empareja con adenosina opuesta, generando ADN radiomarcado en células en proliferación.
Retire los medios gastados de los pocillos. Agregue un tampón de lisis para lisar las células y liberar ADN en la suspensión.
Prepare el conjunto del recolector de células colocando los tubos colectores del recolector sobre los pocillos de la microplaca.
Aplique presión de succión para permitir la aspiración de ADN suspendido de los pocillos. Este ADN se deposita en el papel de filtro, formando manchas específicas.
Recorta los trozos de papel de filtro con manchas de ADN. Transfiera estos chads individualmente a viales de centelleo.
Superponga el papel de filtro con un cóctel de centelleo. Coloque el vial en un contador de centelleo líquido.
Dentro del mostrador, el ADN marcado emite energía por desintegración radiactiva. Esta energía es absorbida por los componentes del cóctel de centelleo. Eventualmente, los componentes del cóctel comienzan a transferir los pulsos, que a su vez son absorbidos por el sensor.
La cantidad de radiactividad detectada determina el grado de división celular.
Colocar 100.000 células en pocillos triplicados en una placa de 24 pocillos. Después de 46 horas, agregue timidina tritiada al medio de cultivo e incube a 37 grados centígrados durante 2 horas.
Luego, después de retirar el medio, agregue 300 microlitros de tripsina-EDTA al 0,25% precalentado e incube durante 20 minutos a 37 grados centígrados para separar las células y liberar el ADN. Luego, encienda el recolector de células y encienda la bomba.
Coloque el papel de filtro en el recolector de celdas. Siga recogiendo los tubos del recolector de células en una bandeja vacía en blanco. Luego, presione prelavado para humedecer el papel de filtro. Coloque los tubos colectores en pocillos de muestra y comience.
Utilice una fuente de luz caliente para secar el papel de filtro y coloque los viales correspondientes en la bandeja. Perfore los trozos de papel en los viales y luego agregue 2 mililitros de cóctel de centelleo líquido a cada vial.
Incube los viales durante 1 hora en el contador de centelleo antes de operar la máquina para obtener los recuentos por minuto de cada muestra, que refleja la síntesis de ADN activa.