Aislamiento de astrocitos: un método para obtener la preparación pura de astrocitos corticales de ratón

El cultivo in vitro de astrocitos ayuda a investigar el papel biológico de los astrocitos, las células cerebrales más abundantes.

Comience con un cerebro de ratón neonatal colocado bajo un microscopio de disección.

Retire los bulbos olfatorios y el cerebelo.

Realice una incisión en la línea media entre los dos hemisferios para separar la corteza.

Retire las meninges para evitar la contaminación en el cultivo de astrocitos por fibroblastos y células meníngeas.

Transfiera los hemisferios de la corteza a un medio helado y pique en trozos pequeños.

Recoja las piezas corticales en un tubo que contenga tripsina. La tripsina, una enzima proteasa, digiere las proteínas de adhesión celular, facilitando la separación celular.

Centrifugar para granular el tejido digerido.

Retire el sobrenadante y agregue un medio de astrocitos al gránulo. Pipetea vigorosamente para liberar una población celular mixta de astrocitos, microglía y células precursoras de oligodendrocitos u OPC.

Siembre esta suspensión celular en un matraz de cultivo de tejidos recubierto de polilisina e incube.

Las células cargadas negativamente se adhieren a la polilisina cargada positivamente y crecen por toda la superficie para formar una capa confluente.

Agite el matraz para separar la microglía y los OPC sueltos. Retire el sobrenadante que contiene células desprendidas.

Agregue tripsina a la capa de astrocitos. Recoge las células y centrifuga.

Vuelva a suspender el gránulo y divida los astrocitos en varios matraces.

Finalmente, evalúe la pureza del cultivo de astrocitos mediante la inmunotinción de marcadores específicos de células.

Transfiera el plato que contiene los cerebros a un microscopio estereoscópico. A continuación, para aislar las cortezas, agarre el extremo posterior de cada cerebro con fórceps finos y realice una incisión en la línea media entre los hemisferios.

Luego, inserte un segundo juego de fórceps en el surco creado y retire la estructura en forma de placa de la corteza del resto del cerebro.

Una vez que se hayan aislado todas las cortezas, retire con cuidado las meninges de la corteza tirando con las pinzas finas. Este paso evita la contaminación del cultivo final de astrocitos por células meníngeas y fibroblastos.

Transfiera los hemisferios corticales preparados a un segundo plato lleno de HBSS frío y colóquelo en hielo. Continúe en consecuencia con las cuatro cortezas. Finalmente, corte cada hemisferio en cuatro a ocho trozos pequeños con cuchillas afiladas.

En condiciones estériles, transfiera los trozos de corteza a un tubo Falcon de 50 mililitros y agregue HBSS a un volumen final de 22,5 mililitros. Luego, agregue 2,5 mililitros de tripsina al 2,5%.

Vuelva a colocar la tapa, mezcle e incube el pañuelo en el baño de agua a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Mezclar agitando cada 10 minutos. Luego, después de centrifugar durante 5 minutos a 300 x g para granular los trozos de tejido de la corteza, decantar cuidadosamente el sobrenadante.

Agregue 10 mililitros de medio de recubrimiento de astrocitos al gránulo y use una pipeta de 10 mililitros para pipetear vigorosamente el medio que contiene el tejido hacia arriba y hacia abajo de 20 a 30 veces hasta obtener una suspensión de una sola célula.

A continuación, agregue medio de siembra de astrocitos a un volumen final de 20 mililitros y cuente las células usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado de acuerdo con los procedimientos estándar.

Una preparación de cuatro cortezas de cachorros de ratón debe producir de 10 a 15 veces 10 a la sexta célula individual disociada. Finalmente, aspirar la poli-D-lisina de un matraz previamente preparado y transferir la suspensión celular disociada al matraz.

Incube el cultivo a 37 grados centígrados en la incubadora de cultivo de tejidos durante 2 días y luego cambie el medio. A partir de entonces, los medios deben cambiarse cada 3 días.

El astrocito debe aparecer confluente con una capa suprayacente de microglía después de 7 a 8 días en cultivo. En este punto, coloque el matraz T75 en un agitador orbital a 180 rotaciones por minuto durante 30 minutos para eliminar la microglía.

Deseche el sobrenadante que contiene microglía o gírelo hacia abajo y colóquelo en una placa para cultivo. Luego, agregue 20 mililitros de medio de cultivo de astrocitos fresco y continúe agitando el matraz a 240 rpm durante 6 horas para eliminar las células precursoras de oligodendrocitos.

Dado que algunos OPC no se desprenden completamente de la capa de astrocitos, continúe agitando vigorosamente con la mano durante 1 minuto para evitar la contaminación por OPC. Nuevamente, deseche el sobrenadante o gírelo en una placa para cultivar OPC.

Enjuague la capa restante de astrocitos confluentes dos veces con PBS. Aspirar el PBS y añadir 5 mililitros de tripsina-EDTA. Incubar en la incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados.

Verifique el desprendimiento de astrocitos cada 5 minutos y haga cumplir el desprendimiento de astrocitos golpeando el matraz contra la palma de su mano dos o tres veces.

Una vez que los astrocitos se hayan desprendido del matraz, agregue 5 mililitros de medio de cultivo de astrocitos. Gire las células a 180 x g durante 5 minutos, aspire el sobrenadante y agregue 40 mililitros de medio de recubrimiento de astrocitos fresco.

Un matraz T75 de células corticales mixtas debería producir alrededor de 1 por 10 a la sexta células enriquecidas para astrocitos después del primer paso.