Cultivo de células endoteliales a partir de microvasos cerebrales de rata: un procedimiento para aislar y cultivar células endoteliales a partir de microvasos de cerebro de rata

Para aislar las células endoteliales del cerebro, primero, transfiera un cerebro de rata recolectado a un plato que contenga tampón refrigerado.

Después de extirpar el cerebelo y los nervios ópticos, divida el cerebro en hemisferios cerebrales. Luego, separe el mesencéfalo del prosencéfalo.

Eliminar las meninges y la sustancia blanca que contiene mielina del prosencéfalo, dejando atrás la corteza cerebral para aislar los microvasos.

A continuación, homogeneice la corteza para romper el tejido nervioso y los constituyentes.

Centrifugar el homogeneizado para eliminar los restos celulares y la mielina.

Posteriormente, trate el gránulo de tejido con un cóctel de digestión que contenga enzimas colagenasa, dispasa y desoxirribonucleasa.

Las colagenasas y las dispasas digieren la matriz extracelular que incrusta los microvasos, aflojando los fragmentos de microvasos del tejido. Las desoxirribonucleasas degradan cualquier ADN libre liberado por las células lisadas.

Mezclar el volumen deseado del homogeneizado digerido con un medio de gradiente de densidad adecuado y centrifugar.

Deseche la capa superior que contiene mielina y células del parénquima cerebral, seguida del sobrenadante.

Ahora, trate el gránulo que contiene microvasos con el cóctel de digestión para liberar completamente los fragmentos de microvasos que comprenden las células endoteliales y los pericitos.

Centrifugar la suspensión. Vuelva a suspender el gránulo que contiene fragmentos de microvasos en un medio adecuado complementado con puromicina, un antibiótico.

Siembre la suspensión en una placa recubierta de proteína de matriz extracelular e incube.

Los fragmentos de microvasos se adhieren al recubrimiento de la placa. La puromicina elimina selectivamente los pericitos, mientras que los componentes del medio facilitan la proliferación de las células endoteliales.

Retire el cerebro del cráneo de tres ratas Wistar de 5 semanas y transfiera los cerebros a una placa de Petri llena de tampón de disección fría sostenido en hielo.

Diseccionar los cerebros sin el cerebelo y los nervios ópticos. Luego, corta cada cerebro por la mitad para separar los dos hemisferios cerebrales.

Bajo el microscopio estereoscópico, haga otro corte para extirpar el mesencéfalo y transfiera todos los prosencéfalos a una placa de Petri limpia en hielo con tampón de disección.

Luego, transfiera un prosencéfalo a una nueva placa de Petri llena de tampón de disección fría. Sosténgalo con la pinza y separe con cuidado las meninges de los bordes del prosencéfalo.

Luego, dé la vuelta al cerebro anterior y retire con cuidado las meninges sin romperlas. Asegúrese de que el prosencéfalo esté limpio de meninges y corte la parte restante de los nervios ópticos. El objetivo de este paso es eliminar el edredón de materia blanca para obtener una capa de corteza.

Comience sujetando el cerebro anterior en el borde y luego arrastre con cuidado las pinzas a lo largo de la superficie, teniendo cuidado de no rasgar la superficie de la corteza.

Luego, asegúrese de que el cerebro esté libre de meninges haciéndolo rodar para verificar que no haya meninges residuales o grandes vasos superficiales.

A continuación, comenzando con la extracción de los tres cerebros de su cráneo, el tiempo completo para la disección no debería tomar más de 2 horas para la preservación del tejido y la supervivencia celular. Transfiera las cortezas de tres cerebros a 6 mililitros de tampón de disección en frío en un homogeneizador Dounce de 7 mililitros.

Posteriormente, disociar las cortezas con 10 movimientos hacia arriba y hacia abajo con el primer mortero de mayor aclaramiento, seguido de 10 movimientos hacia arriba y hacia abajo con el segundo mortero de menor aclaramiento.

Luego, transfiera 6 mililitros de la suspensión a un nuevo tubo Falcon de 50 mililitros y lave el homogeneizador Dounce con 24 mililitros de tampón de disección en frío. Divida la suspensión en tres tubos Falcon para obtener el equivalente a una corteza por tubo.

Después, centrifugar a 1000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. La observación del gránulo muestra un gradiente de color rosa, que representa la parte del microvaso del homogeneizado de las cortezas.

Ahora, deseche el sobrenadante y homogeneice el gránulo de una corteza con 1 mililitro de solución enzimática que contenga una mezcla de colagenasas, dispasa, ADNasa tipo 1 y gentamicina.

Coloque los tubos en una coctelera durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Luego, mezcle 1 mililitro de digestión con 10 mililitros de BSA / HBSS 1X al 25% y agite suavemente los tubos. Posteriormente, separarlos mediante centrifugación dependiente de la densidad a 3.600 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Después de la centrifugación dependiente de la densidad, el gránulo contiene los microvasos y el disco superior contiene mielina, parénquima cerebral y microvasos residuales.

Transfiera con cuidado el disco superior y el sobrenadante a tubos Falcon limpios de 50 mililitros; tenga cuidado de no aspirar el gránulo del microvaso.

Agite suavemente el tubo y repita la centrifugación dependiente de la densidad. Durante esta segunda centrifugación, mantenga el gránulo resultante que contiene los microvasos a 4 grados centígrados.

Después de la segunda centrifugación dependiente de la densidad, deseche con cuidado el disco superior y el sobrenadante. Mezclar y volver a suspender los gránulos resultantes que contienen los microrecipientes de ambas centrifugaciones con 1 mililitro de HBSS 1X frío.

A continuación, lave los microrecipientes con 20 mililitros de HBSS 1X frío y centrifugue a 1.000 x g durante 5 minutos. Luego, deseche el sobrenadante, teniendo cuidado de no perder el gránulo de microvasos.

Homogeneizar el pellet de microvasos de una corteza con 1 mililitro de la misma solución enzimática siguiendo un suave vórtice de los tubos. Además, digiera los microvasos durante 1 hora a 37 grados centígrados en una coctelera. Después de eso, mezcle los microvasos digeridos de las tres cortezas en un tubo.

Nuevamente, separe la mezcla en dos tubos Falcon de 50 mililitros para obtener los microvasos extraídos del equivalente a una corteza y media por tubo. Luego, centrifugar a 1.000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Justo antes de enchapar los microrecipientes, tome dos matraces T75 recubiertos de la incubadora y aspire el exceso de recubrimiento. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento del microvaso en 1 mililitro de ECM.

Lleve cada tubo a 10 mililitros con ECM suplementado con 4 microgramos por mililitro de puromicina para iniciar el proceso de purificación y coloque los microvasos en el matraz.

Luego, coloque los matraces en la incubadora a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono para permitir la adhesión de los microvasos a la matriz de colágeno-fibronectina.