Aislamiento de células cerebrales de larvas de pez cebra: una técnica para obtener neuronas, macrófagos y microglía intactos a partir de tejido cerebral de pez cebra

El cerebro del pez cebra consta de neuronas, células nerviosas que juegan un papel destacado en el procesamiento de la información. Además, comprende una población de células inmunitarias de apoyo, incluidos macrófagos y microglía, que habitan en el espacio interneuronal.

Para aislar todos estos tipos de células cerebrales de un pez cebra, primero, tome larvas de pez cebra anestesiadas en una placa de Petri que contenga los medios apropiados.

Visualice el pez cebra bajo un microscopio estereoscópico y corte las cabezas de las larvas por encima del saco vitelino para mantener el cerebro intacto.

Transfiera las cabezas extirpadas a un homogeneizador lleno de medios preenfriados, colocado sobre hielo. La baja temperatura ayuda a prevenir la degradación de las células cerebrales.

Con un mortero, homogeneizar el tejido cerebral del pez cebra. La homogeneización desintegra la matriz extracelular e inicia la disociación de neuronas, macrófagos y microglía del tejido cerebral.

Este paso también separa la mielina, una capa aislante rica en lípidos, de las neuronas.

Pase el homogeneizado a través de un colador para atrapar grupos de células grandes.

Centrifugar el filtrado para peletizar las células y los fragmentos de la vaina de mielina. Deseche el sobrenadante que contiene desechos.

Vuelva a suspender el gránulo en un medio de gradiente de densidad apropiado y cúbralo con un tampón.

Gira por el tubo a baja velocidad. Los fragmentos de mielina más claros forman una banda distinta en la interfaz del tampón y los medios de gradiente de densidad, mientras que las células más densas se asientan en la parte inferior.

Aspire las capas superiores y vuelva a suspender las células cerebrales en medios nuevos para su uso posterior.

Agregue 1,5 mililitros de tricaína 15 milimolares por 50 mililitros de medio a 50 larvas para preparar la anestesia. Luego, use una pipeta Pasteur de 3 mililitros para transferir 10 larvas a la vez a una placa de Petri de 55 milímetros llena de medio E3 helado con tricaína para anestesiarlas terminalmente.

Bajo un microscopio estereoscópico, alinee 10 larvas en el centro de la placa de Petri. Luego, con unas tijeras quirúrgicas, corte las cabezas de las larvas por encima del saco vitelino.

Con una pipeta Pasteur de 3 mililitros, tome todos los cabezales y, con la menor cantidad de líquido posible, transfiéralos a un homogeneizador de vidrio sobre hielo que contenga 1 mililitro de Media A helado.

Reemplace cada placa de Petri pequeña que contenga E3 helado más tricaína por una nueva cada 30 minutos para asegurar que la transección se realice en medio frío E3 más tricaína.

Reemplace el medio A helado en el homogeneizador de vidrio cuando el color comience a desvanecerse. Una vez que se haya recogido todo el grupo de cabezales, retire todo el Medio A del homogeneizador de vidrio y reemplácelo con 1 mililitro de Medio A fresco y helado.

Con el homogeneizador todavía en hielo, use un mortero ajustado para alterar el tejido cerebral realizando 40 rondas de trituración y vueltas para 3 a 5 larvas dpf y 50 rondas para 7 y 8 larvas dpf.

Luego, agregue 2 mililitros de Media A a la suspensión celular para diluir las células y reducir su aglomeración con mielina. Elimine la aglomeración celular pasando la suspensión celular a través de un colador celular de 40 micrones en un tubo de halcón frío de 50 mililitros sobre hielo. Repita este paso tres veces.

Transfiera alícuotas de 1 mililitro de suspensión celular en tubos fríos de 1,5 milímetros y gírelos a 300 x g y 4 grados centígrados durante 10 minutos. Luego, usando una jeringa de 10 mililitros con la aguja de 23G x 1", retire el sobrenadante.

Con 1 mililitro de medio de gradiente de densidad helado del 22%, suavemente superpuesto por 0,5 mililitros de 1x DPBS helado, vuelva a suspender suavemente el gránulo celular. Gire los tubos a 950 x g sin descanso y acelere lentamente a 4 grados centígrados durante 30 minutos.

Después del giro, deseche el medio de gradiente de densidad DPBS y la mielina atrapada en la interfaz. Luego, use 0,5 milímetros de Medio A con NGS al 2% para lavar las células y centrifugar los tubos a 300 x g a 4 grados Celsius durante 10 minutos.

Retire la mayor cantidad posible de sobrenadante, luego junte los gránulos celulares de la misma condición experimental en 1 mililitro de Medio A con NGS al 2%.

Si las células de interés expresan una proteína fluorescente, pase la suspensión celular a través de una tapa de filtro celular de 35 micras y transfiéralas a tubos fríos FACS de 5 mililitros sobre hielo protegido de la luz.