Generación de Células Madre Neurales Inducidas (iNSCs) a partir de Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMNCs): Un Procedimiento Basado en el Virus de Sendai para Reprogramar PBMNCs en iNSCs

Para reprogramar las células somáticas en células madre neurales inducidas o iNSC, células madre que poseen una alta capacidad de autorrenovación y diferenciación, comience cultivando células mononucleares de sangre periférica en un medio libre de suero para expandir los eritroblastos.

A continuación, pipetee la suspensión de eritroblastos en una placa de cultivo. Tratar las células con el virus Sendai recombinante o SeV. Estos virus codifican factores de transcripción de reprogramación. Centrifugar para sedimentar las células e incubar.

Después de la fusión de SeV a la membrana de la célula huésped, el genoma del virus se somete a una transcripción seguida de una traducción en el citoplasma. La expresión ectópica de los factores de transcripción desencadena el proceso de reprogramación celular sin integrar los genes en el genoma del huésped.

Ahora, centrifuga el cultivo para eliminar los virus. Vuelva a suspender las células transducidas en un medio adecuado, seguido de la siembra. Además, centrifugar para eliminar los desechos celulares. Vuelva a suspender las celdas en medios iNSC.

Posteriormente, siembre las células en una placa recubierta de proteínas. Las células se adhieren al recubrimiento de proteínas en la placa. Complemente las células adheridas con medios iNSC en días alternos. Después de una semana de cultura, reemplace los medios gastados con medios nuevos de iNSC todos los días.

Los factores de crecimiento y los componentes químicos en los medios mantienen la autorrenovación y apoyan la pluripotencia de un subconjunto de células transducidas, reprogramándolas completamente a iNSC. Con el tiempo, las células comienzan a formar colonias de iNSC. Seleccione las colonias deseadas para el cultivo.

El día 0, recolecte las células en medio MNC y transfiéralas a un tubo cónico de 15 mililitros. Después de centrifugar las células a 200 x g durante 5 minutos, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células con 1 mililitro de medio MNC precalentado. Cuente las células viables con azul de tripano y luego vuelva a suspenderlas con medio MNC precalentado a una concentración de 200,000 células por pocillo en placas de 24 pocillos.

Descongele los tubos extraídos del almacenamiento a menos 80 grados Celsius que contienen el virus Sendai en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 5 a 10 segundos y luego déjelos descongelar a temperatura ambiente. Una vez descongelados, colóquelos inmediatamente sobre hielo. Agregue el virus Sendai descongelado a los pocillos de la placa de 24 pocillos con MNC en una multiplicidad de infección de 10. Para facilitar la unión de las células, centrifugue las placas a 1.000 x g durante 30 minutos, y luego coloque las placas en la incubadora a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono.

El día 1, transfiera las células con el medio a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Para separar aún más las células restantes, enjuague los pocillos con 1 mililitro de medio MNC por pocillo y agregue las celdas con medio al tubo. Después de centrifugar esta suspensión celular a 200 x g durante 5 minutos, aspire el sobrenadante, vuelva a suspender las células con 500 microlitros de medio MNC fresco precalentado y agréguelo a un pocillo de una placa de 24 pocillos.

El día 2, use 1 mililitro por pocillo de 50 microgramos por microlitro de poli-D-lisina y D-PBS previamente diluidos para recubrir placas de 6 pocillos durante al menos 2 horas a temperatura ambiente. Aspire la poli-D-lisina de las placas de 6 pocillos y séquelas en el banco de limpieza vertical durante unos 10 minutos. Luego, agregue 1 mililitro por pocillo de una laminina de 5 microgramos por mililitro previamente diluida a las placas de 6 pocillos e incube durante 4 a 6 horas a 37 grados Celsius para cubrir. Lave las placas con D-PBS antes de usarlas.

El día 3, coloque en una placa todas las MNC transducidas por el virus Sendai en un medio de células madre neurales inducidas en las placas de 6 pocillos recubiertas de poli-D-lisina laminina. En los días 5 y 7, agregue suavemente 1 mililitro de medio iNSC precalentado a 37 grados Celsius a cada pocillo de las placas de 6 pocillos.

Desde el día 9 hasta el día 28, reemplace el medio con medio iNSC fresco precalentado diariamente. Monitoree la aparición de colonias de iNSC y, en aproximadamente 2 a 3 semanas, recoja colonias con la morfología adecuada utilizando pipetas de vidrio quemado. Luego, transfiera cada colonia a un pocillo separado de una placa de 6 pocillos para su expansión.