Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Investigación sobre el cáncer
0 visualizaciones • 4:07 min. • July 8th, 2025
La tecnología de reacción en cadena de la polimerasa digital en gotas o dPCR divide los reactivos de una sola reacción de PCR en millones de reacciones de PCR de nanogotas. Esta partición masiva seguida de amplificación detecta una cantidad diminuta de ADN mutante contra un gran fondo de ADN de tipo salvaje, lo que permite la detección temprana del cáncer.
Para comenzar, aspire la mezcla maestra de dPCR que contiene oligonucleótidos marcados con fluorescencia junto con otros reactivos de PCR y un aceite estabilizador de gotas. Agregue esta mezcla maestra directamente en el fondo de cada pocillo en un tubo de tira de PCR para evitar burbujas de aire. A continuación, agregue muestras de ADN a la mezcla de reacción y pipetee varias veces para mezclar.
Ahora, transfiera toda la mezcla de reacción a un chip especializado de un instrumento generador de gotas. Monte un tubo de tira de PCR nuevo en el instrumento generador de gotas. El generador de gotas combina la muestra y el aceite para formar nanogotas discretas con un área encapsulada que evita la contaminación cruzada entre las gotas.
Una vez completada la gota, transfiera el tubo de tira de PCR a un termociclador para amplificar el ADN objetivo. Posteriormente, cargue el producto de PCR en un lector de gotas que contenga un detector de fluorescencia, que cuenta las gotas fluorescentes positivas y negativas. El número de gotas positivas se puede utilizar para calcular la concentración de ADN objetivo en la muestra.
Antes de comenzar el procedimiento de PCR digital en gotas, limpie el espacio y el equipo de la mesa con lejía al 10% y etanol al 70% y centrifugue suavemente y centrifugue brevemente todos los reactivos excepto el aceite estabilizador de gotas. Confirme que el cilindro de gas nitrógeno comprimido esté conectado al instrumento generador de gotas y que el tanque del cilindro esté configurado en 90 libras por pulgada cuadrada. Agregue 38 microlitros de mezcla de reacción de PCR digital directamente en el fondo de cada pocillo de una tira de tubo de PCR de 8 pocillos eliminando cualquier burbuja con una punta de pipeta limpia.
Agregue 12 microlitros de muestra de ADN preamplificada por triplicado a los pocillos apropiados de la tira de tubo. Pipetee suavemente el volumen completo 10 veces para mezclar la mezcla de reacción con la muestra de ADN y pipetee el volumen completo de cada pocillo en el A correspondiente a través de los canales H de un chip de instrumento generador de gotas. Inserte una nueva tira de tubo de PCR en el instrumento generador de gotas y escanee la identificación del chip del instrumento generador de gotas en el software de la computadora del instrumento.
Luego, haga clic en "Iniciar la ejecución" para comenzar a dropletizar muestras. Cuando se complete la gota, retire la tira del tubo de PCR y aplique las tapas de la tira del tubo. Transfiera la tira de tubo a un termociclador y equilibre el tubo con otra tira de tubo que contenga 80 microlitros de agua por pozo. Luego, haga funcionar el termociclador en las condiciones de ciclo térmico adecuadas. Reemplace las tapas de las tiras con tapas de alta velocidad.
Cuando se complete el ciclo térmico, transfiera la tira de tubo al instrumento de cuantificación. Haga clic en "Configurar una ejecución" en el software del instrumento y coloque la tira de tubo en el instrumento de cuantificación. Coloque el protector metálico encima de un nuevo chip de instrumento de cuantificación. Escanee la identificación del chip en el instrumento e inserte el chip en la máquina. Cierre la tapa del instrumento. En el software de la computadora, ingrese un nombre para la ejecución de PCR digital y para cada uno de los ocho canales. Luego, seleccione "Modo rápido" y haga clic en "Iniciar" para comenzar la cuantificación.