Preparación de andamios sembrados MSC: una técnica para preparar andamios sembrados con células madre mesenquimales para su implantación quirúrgica en un modelo murino

Las células cancerosas producen factores quimiotácticos para atraer las células madre mesenquimales o MSC de los vasos sanguíneos hacia la ubicación del tumor.

Para estudiar el efecto de estas células en el crecimiento tumoral in vitro, comience tomando un sustrato de andamio esterilizado. Transfiéralo a una placa de pocillos que contenga los medios deseados para humedecer previamente el andamio. Colóquelo sobre una superficie seca para eliminar el exceso de medios adheridos al andamio para una mejor adhesión celular. Transfiera el andamio parcialmente seco a un pozo fresco. Siembre una gota de suspensión MSC en el andamio.

Además, agregue más medios en las esquinas del pocillo para crear una cámara de hidratación que evite la evaporación de los medios de la gota durante la incubación posterior. Incube para permitir que las MSC se adhieran a la superficie del andamio. Voltee el andamio para exponer la superficie sin semillas. Pipetea una gota fresca de suspensión MSC en este lado y deja que los MSC se adhieran.

Después de que las MSC se hayan adherido a ambos lados del andamio, cúbralo con más medios asegurándose de que todas las células estén en contacto con los medios. Incube hasta que las MSC crezcan y se infiltren dentro de los intersticios y poros del andamio. El andamio sembrado MSC está listo para la implantación quirúrgica.

Prepare los andamios 48 horas antes de la implantación en ratones cortando primero los andamios de PLA en trozos del tamaño de una cavidad de resección de aproximadamente 2 por 2 milímetros. Esterilice los andamios sumergiéndolos en etanol al 70% durante 15 minutos. Después de 15 minutos, sumerja los andamios en PBS. Luego, coloque los andamios en el medio de águila modificado de Dulbecco que contiene un 10% de suero fetal bovino y un 1% de penicilina-estreptomicina mientras prepara las células para la siembra.

Para preparar las células, primero, levante las MSC cultivadas con tripsina al 0,05%. Incubar a 37 grados centígrados durante 5 minutos. Después de la incubación, asegúrese de que las células se hayan levantado. A continuación, agregue DMEM al matraz para inactivar la tripsina. A continuación, transfiera el contenido del matraz a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Cuente las células con un hemocitómetro. A continuación, granular 5 veces 10 hasta el quinto MSC para cada andamio mediante centrifugación a 100 x g durante 5 minutos.

Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las MSC en 5 microlitros de DMEM por 5 veces 10 a las quintas celdas. A continuación, retire un andamio de la inmersión en DMEM con pinzas y colóquelo en la tapa de la placa de 6 pocillos. Levante el andamio de la tapa, dejando una gota de exceso de DMEM. Vuelva a colocar el andamio en la tapa nuevamente en un lugar nuevo y seco. Repita de tres a cinco veces. Luego, coloque el andamio parcialmente seco en una nueva placa de 6 pocillos para sembrar.

Un andamio parcialmente seco proporciona resultados óptimos de siembra celular. Si el andamio está demasiado húmedo, las células se deslizarán del andamio y se adherirán a la placa de abajo. Si el andamio se seca, la gota no se extenderá por todo el andamio, lo que resultará en una mala distribución celular inicial.

Con una pipeta, mezcle suavemente el tubo de MSC para homogeneizar la suspensión, ya que algunas células pueden haberse asentado en el fondo. Pipetee lentamente 2,5 microlitros de suspensión MSC recién mezclada directamente sobre el andamio, creando una pequeña gota sobre la parte superior del andamio. Agregue 300 microlitros de DMEM a los bordes de cada pocillo para evitar la rápida evaporación de la gota celular. Incube a 37 grados centígrados durante 30 minutos, permitiendo que las células se adhieran al andamio.

Después de la incubación, use fórceps para voltear suavemente los andamios en la placa de pocillos. Sembrar 2,5 microlitros de suspensión de MSC recién mezclada para dar un total de 5 veces 10 a las quintas células sembradas por andamio. Después de una incubación de 30 minutos para permitir que las células se adhieran al andamio, cubra los andamios en DMEM agregando 2 mililitros a cada pocillo de la placa de 6 pocillos. Levante suavemente los andamios para permitir que los medios fluyan debajo de ellos. Incube a 37 grados centígrados en este estado durante 48 horas antes de la cirugía de implantación.