Resección tumoral guiada por fluorescencia e implantación de andamio sembrado con MSC en modelo murino: un procedimiento quirúrgico para administrar células madre mesenquimales terapéuticas en la cavidad de resección de tumores cerebrales en un modelo de ratón

Las células madre mesenquimales o MSC se pueden diseñar genéticamente para expresar el ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral o TRAIL, que se une a receptores específicos en las células tumorales que inducen la apoptosis.

Para administrar estas MSC en un modelo de ratón portador de tumores, primero, prepare un andamio de biopolímero sembrado con MSC que exprese TRAIL. A continuación, asegure un ratón anestesiado con un tumor cerebral marcado con fluorescencia en un marco estereotáctico. El ratón tiene una ventana craneal preestablecida para acceder al cerebro.

Mantenga la temperatura corporal del ratón con una almohadilla térmica. Esterilice el sitio quirúrgico y haga una incisión en la línea media del cuero cabelludo. Retire la grasa subdérmica para revelar la ventana craneal. Despegue la duramadre de la ventana, exponiendo el tejido parenquimatoso subyacente y el tumor.

Ahora, bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia, visualice el tumor fluorescente. Aspirar el tejido tumoral fluorescente del cerebro. Lavar con suero fisiológico para restaurar el pH fisiológico. Implante el andamio sembrado con MSC en la cavidad de resección. Aplique un agente hemostático adecuado para asegurar el andamio en su lugar. Cierre la incisión y deje que el ratón se recupere.

Después de la implantación, las células tumorales dentro de los focos tumorales residuales secretan factores solubles, que facilitan la migración de MSC desde el andamio hacia las células tumorales. Las proteínas TRAIL secretadas por las MSC se unen a receptores específicos en las células tumorales, induciendo la muerte celular apoptótica.

Comience colocando el marco estereotáxico en la platina de un microscopio estereoscópico de disección de fluorescencia. Luego, asegure el ratón anestesiado en el marco estereotáxico con un suministro continuo de anestesia inhalada a través de un adaptador de cono nasal de isoflurano. Mantenga la temperatura corporal con una almohadilla térmica. Aplique ungüento oftálmico en los ojos para evitar la sequedad de la córnea. Luego, esterilice el sitio de la incisión del cuero cabelludo con una serie de tres toallitas con alcohol y tres betadine.

Realice la prueba del reflejo de pellizco del dedo del pie en cada extremidad y confirme la respuesta negativa para garantizar una anestesia adecuada. Con fórceps, pellizque y levante suavemente el cuero cabelludo. Después de hacer una incisión lineal rostral-caudal en la línea media con tijeras quirúrgicas, irrigar el sitio de la incisión con PBS y eliminar la grasa subdérmica con un aplicador de punta de algodón con un movimiento de cepillado circular.

Organice la piel de modo que la ventana craneal previamente establecida sea completamente visible. Use una aguja de calibre 18 para perforar suavemente la duramadre justo adentro de los bordes de la ventana craneal. Repita hasta que la incisión trace completamente el interior de la ventana. Retire la duramadre pelándola con pinzas finas, revelando el parénquima y el tumor subyacentes.

A continuación, atenúe las luces de la habitación y active el modo de fluorescencia del microscopio estereoscópico. Localice el tumor que expresa luciferasa U87 mCherry y luciérnaga. Cargue una punta de pipeta de 200 microlitros en el extremo del tubo de una bomba de vacío. Luego, encienda la bomba de vacío. Reseque el tumor aspirando suavemente el tejido fluorescente hasta que no quede señal. Para controlar el sangrado, irrigar con PBS frío y aplicar presión constante con un aplicador de punta de algodón.

Use una combinación de solución salina, presión constante con un aplicador de punta de algodón y / o un agente hemostático, como SURGICEL, para detener el sangrado antes de implantar el andamio. Si no se controla adecuadamente, se puede formar un hematoma potencialmente peligroso. Después de la resección, apague la bomba de vacío y deseche la punta de la pipeta. Apague la fluorescencia y la habitación se volverá a encender. Inmediatamente antes de la implantación, sumerja lentamente un andamio de PLA sembrado con MSC en PBS para eliminar los medios no deseados y los componentes asociados. Implante el andamio en la cavidad de resección.

Si es necesario, agregue 1 microlitro de fibrinógeno, seguido de 1 microlitro de trombina para asegurar el andamio en su lugar. Con la duramadre extraída y el colgajo óseo de la ventana craneal ya desechado, selle la herida cerrando la piel y aplicando pegamento quirúrgico. Retire al animal del anestésico inhalado y deje que se recupere en una superficie caliente.