Marcaje fluorescente de células de glioma: un método de transfección basado en vectores lentivirales para obtener células de glioma que expresan proteínas fluorescentes para la obtención de imágenes de tejidos profundos

0 vistas3:39 min • July 8th, 2025

Las imágenes de cáncer cerebral in vivo implican inyectar células cancerosas marcadas con fluorescencia en el cerebro del ratón para observar el desarrollo del tumor. Para el marcado fluorescente, incube las células de glioma con partículas de lentivirus. El vector lentiviral lleva el gen de la proteína fluorescente infrarroja, iRFP.

El virus se une a la superficie celular del glioma y libera ARN en la célula. Las enzimas celulares convierten el ARN viral en ADN bicatenario, que se integra en el genoma celular y permite la expresión de iRFP. Los máximos de excitación y emisión de iRFP se encuentran dentro de una región del infrarrojo cercano donde los tejidos tienen una absorbancia y dispersión mínimas. Esto permite obtener imágenes precisas de tejidos profundos.

A continuación, retire el medio gastado y agregue tripsina. La tripsina, una enzima proteasa, digiere las proteínas de adhesión, separando las células de la superficie del matraz. Pipetear repetidamente para separar las células individuales. Recoja la suspensión celular en un tubo y centrifuge. Ahora, agregue un tampón adecuado para volver a suspender el gránulo.

Dispense la suspensión celular en tubos de citometría de flujo y tiña las células con un tinte fluorescente, DAPI. DAPI tiñe el núcleo de las células muertas de azul brillante, distinguiéndolas de las células vivas. Usando un clasificador de células activado por fluorescencia o FACS, clasifique las células vivas positivas para iRFP de otras poblaciones celulares en función de su fluorescencia. Las células aisladas se pueden usar para inyectar en ratones para obtener imágenes de tumores.

Comience sembrando 1 por 10 hasta el sexto glioblastoma en 5 mililitros de medio en un plato de 10 centímetros para una incubación de 24 horas en una incubadora de cultivo celular. A la mañana siguiente, transducir las células con lentivirus que expresan una proteína fluorescente apropiada de interés en una multiplicidad de infección de 5 y devolver las células a la incubadora.

Después de 24 horas, reemplace el sobrenadante con 5 mililitros de medio fresco e incube el cultivo durante otras 48 horas. Al final de la incubación, reemplace el medio con 3 a 5 mililitros de tripsina durante 10 a 15 minutos a 37 grados centígrados, seguido de un pipeteo cuidadoso para disociar completamente las células desprendidas.

Recoger las células por centrifugación y volver a suspender el pellet en 500 microlitros de solución de clasificación. Divida las células en el número adecuado de tubos FACS y coloque las células con DAPI para la exclusión de células muertas. Luego, cargue los tubos en el citómetro de flujo y clasifique las células vivas de acuerdo con su expresión de construcción fluorescente en un tubo cónico de 15 mililitros que contiene una solución de clasificación fresca.

Después de la centrifugación, vuelva a suspender las células constructo-positivas/DAPI-negativas en 5 mililitros de medio de cultivo y siembre en un nuevo plato de 10 centímetros para su cultivo a 37 grados centígrados durante 48 a 72 horas. Al final de la incubación, divida las células para sembrarlas en múltiples placas para experimentos in vivo posteriores.

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Última actualización: 29 agosto 2026