Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Investigación sobre el cáncer
0 visualizaciones • 4:15 min. • July 8th, 2025
Las células madre tumorales cerebrales o BTSC, una subpoblación de células tumorales cerebrales, pueden iniciar el crecimiento tumoral y la metástasis, lo que las convierte en objetivos prometedores para la terapia del cáncer. Para estudiar el efecto de los fármacos sobre la migración de BTSC in vitro, primero, preparar suspensiones uniformes de BTSC en un medio adecuado. Trate una de las suspensiones con el medicamento de interés.
Mientras tanto, obtenga una placa de quimiotaxis de múltiples pocillos que consta de insertos membranosos que separan cada pocillo en cámaras superior e inferior. Pipetee la proteína de la matriz extracelular deseada en las cámaras inferiores y los insertos membranosos. Incubar para facilitar la polimerización de la proteína.
Agregue un medio basal adecuado que contenga el quimioatrayente deseado a las cámaras inferiores y colóquelo sobre los insertos membranosos. A continuación, siembre la suspensión de BTSC tratada con fármaco y no tratada en insertos membranosos. Obtener imágenes de la placa durante un período prolongado mediante microscopía de células vivas.
En cultivo, las BTSC se adhieren a la matriz proteica del inserto. En respuesta al gradiente de concentración de quimioatrayente establecido entre las cámaras superior e inferior, las BTSC no tratadas migran a través de la matriz proteica a través de los poros de inserción de la membrana a la cámara inferior.
Sin embargo, el tratamiento farmacológico afecta negativamente la actividad funcional de las células, disminuyendo la migración de BTSC. Ahora, utilizando el software adecuado, analice y cuantifique las BTSC migradas en las cámaras inferiores. Las BTSC no tratadas muestran una mayor migración, mientras que las BTSC tratadas con fármacos muestran una migración reducida.
Para evaluar los efectos de un tratamiento farmacológico de interés sobre la migración, en primer lugar, pretratar las células con la concentración adecuada del fármaco durante un período experimental adecuado. Para preparar la placa de quimiotaxis, cubra tres pocillos de inserción de membrana y tres pocillos de depósito inferior según la condición de una placa de quimiotaxis de 96 pocillos con 75 y 225 microlitros de 0,2 miligramos por mililitro de colágeno tipo I, respectivamente, durante 1 hora a 37 grados Celsius.
Al final de la incubación, aspire la solución de colágeno de cada pocillo sin rayar el recubrimiento de colágeno y lave los pocillos dos veces con PBS estéril. Después del último lavado, retire el inserto de la placa y agregue 225 microlitros de medios sin factor de crecimiento complementados con un 10% de FBS a cada pocillo del depósito inferior de la placa de quimiotaxis.
Luego, regrese suavemente el inserto superior al depósito inferior en ángulo para evitar la creación de burbujas y agregue 2.5 veces 10 a las terceras BTSC disociadas en 50 microlitros de medios sin factor de crecimiento a cada pocillo de inserto. Es importante disociar completamente las BTSC en células individuales y contarlas cuidadosamente antes de sembrar para evitar que haya grupos de células o demasiadas células en el inserto superior.
Para obtener imágenes de la migración de BTSC a lo largo del gradiente FBS, coloque la placa en un sistema de imágenes de células vivas y configure el software de imágenes automatizado para adquirir imágenes microscópicas de la placa cada 1 a 2 horas durante un máximo de 72 horas. Cuando se complete la adquisición de la imagen, seleccione una nueva definición de procesamiento para distinguir las BTSC de sus poros de inserción en la parte inferior de la membrana, modificando el análisis si no distingue con precisión las células de la membrana de fondo según sea necesario.
Para cuantificar las células que han migrado a través de los poros, recopile los datos como el área de superficie celular en la parte inferior de la membrana para cada uno de los tres pocillos replicados por condición. Luego, grafique la migración celular como el área de las células migradas en micrómetros al cuadrado a lo largo del tiempo.