Aislamiento y cultivo de pericitos cerebrales primarios: un procedimiento para aislar y cultivar pericitos de capilares cerebrales bovinos sin contaminación de células endoteliales

En el sistema nervioso central, los pericitos son células multifuncionales que envuelven las células endoteliales, que forman el revestimiento celular interno de los capilares. Los pericitos ayudan a regular el flujo sanguíneo y mantienen la homeostasis cerebral.

Para aislar los pericitos, comience tomando capilares cerebrales bovinos congelados en un vial. Después de descongelar, transfiera el contenido a un tubo que contenga el medio deseado. Centrífuga para peletizar los capilares. Retire el sobrenadante que contiene el medio de congelación. Vuelva a suspender el sedimento capilar en un medio y siembre la suspensión en un matraz recubierto de proteína de matriz extracelular.

Incubar para permitir que los capilares se adhieran al recubrimiento del matraz. Reemplace el medio con medios que contengan heparina. En cultivo, el recubrimiento de proteína de la matriz extracelular promueve que los pericitos migren lejos de los fragmentos capilares y proliferen, mientras que la heparina estimula la migración de células endoteliales.

Reemplace los medios gastados con medios que contengan heparina. Con el tiempo, los pericitos proyectan procesos alargados que se adhieren fuertemente al matraz. Con un espacio de sustrato limitado, las células endoteliales proliferan y forman una monocapa inhibida por contacto. Una vez que logre la densidad adecuada de pericitos, retire el medio y lave el matraz con tampón.

Use tripsina-EDTA para separar las células endoteliales poco unidas del matraz. Posteriormente, agregue medios para neutralizar la actividad de tripsina-EDTA. Lavar con medios repetidamente para eliminar las células endoteliales desprendidas. Agregue medios y asegúrese de que los pericitos permanezcan adheridos al matraz. Incubar el cultivo enriquecido con pericitos para que prolifere.

Comience descongelando un vial de capilares en un baño de agua a 37 grados centígrados. Una vez descongelados los capilares, transfiéralos a un tubo de centrifugación con 30 mililitros de DMEM-comp y centrifugue durante 5 minutos a 500 x g. A continuación, retire el medio del tubo y vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de DMEM-comp fresco. Transfiera la suspensión a un matraz T75 recubierto y deje que los capilares se adhieran al fondo durante 4 a 6 horas en una incubadora a 37 grados Celsius suministrada con un 10% de dióxido de carbono. Después de la incubación, inspeccione el matraz bajo un microscopio óptico.

Ahora se deben unir fracciones de capilares al fondo del matraz. El día 4, después de sembrar los capilares, inspecciónelos bajo el microscopio para asegurarse de que sean aproximadamente 60% a 70% confluentes. Aspire el medio y lave suavemente las células con PBS. Agregue 2 mililitros de tripsina-EDTA descongelada y deje el matraz en la incubadora durante 1 a 3 minutos, sacando el matraz con frecuencia y observando el desprendimiento de células con el microscopio. Cuando las células endoteliales comiencen a redondearse, golpee suavemente el matraz para separarlas.

Cuando las células se hayan desprendido, detenga la tripsinización agregando 10 mililitros de DMEM-comp al matraz. Enjuague el matraz varias veces con el medio y aspire la suspensión de células endoteliales, que ahora se puede usar para otros fines. Agregue 10 mililitros de DMEM-comp al matraz y verifíquelo bajo el microscopio óptico para asegurarse de que los pericitos todavía estén presentes y adheridos al fondo. Luego, vuelva a colocar el matraz en la incubadora para permitir que crezca el cultivo enriquecido con pericitos.