Aislamiento de capilares cerebrales del cerebro humano: un método optimizado para extraer capilares cerebrales del tejido cerebral humano

Los capilares cerebrales son un componente vital de la barrera hematoencefálica, una barrera semipermeable que permite el movimiento selectivo de solutos entre la sangre y el cerebro. Para aislar los capilares cerebrales, comience con tejido cerebral humano fresco. Retire las meninges y corte la materia blanca.

Pica el tejido cerebral en fragmentos más pequeños. Transfiera los fragmentos a un homogeneizador que contenga un tampón adecuado y homogeneice. La homogeneización desintegra los tejidos, liberando capilares y restos de tejido en la solución.

Transfiera el homogeneizado a un tubo nuevo y agregue un volumen óptimo de un medio de gradiente de densidad adecuado. Centrifugar la solución para peletizar los capilares. Demasiado o muy poco medio de gradiente de densidad da como resultado un bajo rendimiento capilar. Retire el sobrenadante.

Vuelva a suspender el gránulo en albúmina sérica bovina o tampón suplementado con BSA. BSA estabiliza las enzimas digestivas y mantiene la integridad estructural de los capilares. A continuación, filtre la solución con un filtro adecuado para eliminar los vasos grandes y los restos de tejido.

Luego, pase el filtrado a través de un filtro de malla más pequeño. Este filtro retiene los capilares cerebrales y permite el paso de desechos más pequeños y glóbulos rojos. A continuación, voltee el filtro y lave los capilares en un tubo nuevo con tampón suplementado con BSA.

Centrifugar la solución y eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender los capilares puros en tampón y guárdelos para su uso posterior.

Para comenzar este procedimiento, documente el peso del tejido cerebral humano, que debe ser de aproximadamente 10 gramos. Bajo el microscopio, retire cuidadosamente todas las meninges con fórceps y use un bisturí para cortar la sustancia blanca. Luego, corte con cuidado el tejido cerebral y píquelo con un bisturí durante unos 5 minutos.

Transfiera el tejido cerebral al molinillo de tejidos y agregue 30 mililitros de tampón de aislamiento. Posteriormente, homogeneizar cada muestra con 100 golpes a 50 rpm. No revuelva el aire para evitar burbujas. Documente el tiempo cada 25 golpes y el tiempo total necesario para 100 golpes. Luego, transfiera el homogeneizado a un homogeneizador Dounce con hielo. Homogeneizar la suspensión durante unos 20 golpes y evitar burbujas.

Luego, distribuya el homogeneizado cerebral por igual en cuatro tubos de centrifugación de 50 mililitros y documente el volumen total del homogeneizado. Asegúrese de añadir el volumen correcto de Ficoll. Muy poco o demasiado Ficoll dará como resultado una densidad incorrecta para separar los capilares de los desechos celulares y, por lo tanto, reducirá el sedimento capilar y limitará el rendimiento.

Use 10 mililitros de tampón de aislamiento para enjuagar el mortero y el homogeneizador y distribuirlo en los cuatro tubos de centrifugación. A continuación, distribuya 50 mililitros de tampón de gradiente de densidad en los tubos de centrifugación. Cierre bien los tubos de centrífuga con tapas. Después, mezcle el homogeneizado, el medio de gradiente de densidad y el tampón agitando vigorosamente los tubos. Centrifugar a 5.800 x g durante 15 minutos a 4 grados centígrados. Posteriormente, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender cada gránulo en 2 mililitros de BSA al 1%.

Después de volver a suspender el gránulo, filtre la suspensión a través de la malla de 300 micrómetros. Los capilares se filtran a través de la malla, mientras que los vasos más grandes y los desechos cerebrales más grandes permanecen en la malla. Lave cuidadosamente la malla con hasta 50 mililitros de BSA al 1%, luego deseche la malla. Para separar los capilares de los glóbulos rojos y otros desechos cerebrales, distribuya el filtrado capilar sobre filtros de deformación celular de 530 micrómetros.

Los capilares son retenidos por este filtro, mientras que los glóbulos rojos, otras células individuales y pequeños desechos cerebrales pasan a través del filtro y se acumulan en el filtrado. A continuación, lave cada filtro con 25 mililitros de BSA al 1%. Vierta todos los filtrados sobre el sexto filtro para aumentar el rendimiento. Lave cada filtro con 50 mililitros de BSA al 1%. Mantenga los filtros de cepa celular que contienen los capilares y deseche el filtrado. Luego, voltee los filtros y lave los capilares con 50 mililitros de BSA al 1% en tubos de 50 mililitros.

Aplique presión suavemente con la punta de la pipeta y muévala por el filtro para eliminar los capilares cerebrales. Asegúrese de lavar todos los capilares cerebrales, especialmente del borde del filtro. Evite las burbujas, ya que esto dificulta el proceso de filtración y aumenta la posibilidad de pérdida capilar. Después de recolectar los capilares, centrifugar todas las muestras a 1.500 x g durante 3 minutos a 4 grados centígrados. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en aproximadamente 3 mililitros de tampón de aislamiento.

Luego, combine todos los gránulos resuspendidos de una muestra en un tubo cónico de 15 mililitros y llénelo con tampón de aislamiento. Centrifugar nuevamente a 1.500 x g durante 3 minutos a 4 grados centígrados y lavar dos veces más. Documente la pureza capilar con un microscopio con un aumento de 100X y una cámara. Los capilares cerebrales aislados ahora se pueden usar para experimentos, procesar o congelar rápidamente y almacenar a menos 80 grados Celsius en criotubos durante un mínimo de 6 a 12 meses.