Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Investigación sobre el cáncer
0 visualizaciones • 3:05 min. • July 8th, 2025
La zimografía es una técnica electroforética que involucra un sustrato proteico copolimerizado con gel de poliacrilamida para detectar enzimas hidrolíticas y su actividad. Para comenzar, disuelva las muestras en un tampón de zimografía que contenga glicerol, dodecil sulfato de sodio o SDS y azul de bromofenol.
El glicerol hace que el tampón de muestra sea más denso que el tampón de funcionamiento circundante del gel, lo que permite una fácil carga en las bolsas de gel. SDS, un detergente aniónico, desnaturaliza las enzimas de la muestra y las recubre con una carga negativa. El azul de bromofenol, un colorante de seguimiento, ayuda a controlar el progreso de la muestra en el gel.
Cargue las muestras en gel de poliacrilamida incrustado con sustratos fluorogénicos para detectar la actividad de la proteasa. Ahora, conecte los electrodos y comience la electroforesis. El campo eléctrico generado hace que todas las enzimas unidas a SDS migren a través del gel hacia el electrodo cargado positivamente.
Una vez finalizada la electroforesis, retire el gel y lávelo en un tampón de renaturalización que contenga detergente no iónico que desplace a SDS para permitir la renaturalización de la enzima. A continuación, incube el gel en un tampón en desarrollo que contenga cationes divalentes que activen las enzimas del gel.
Las proteasas activas escinden los sustratos fluorogénicos, provocando un aumento de la fluorescencia. Tome imágenes del gel para observar bandas de proteínas fluorescentes cuya intensidad es proporcional a la actividad de la proteasa.
Para comenzar, disuelva las muestras en tampón de muestra de zimografía convencional. Agregue 400 mililitros de 1x tampón de funcionamiento Tris-Glycine SDS al aparato de gel. Cargue hasta 35 microlitros de muestra por pocillo. Ejecute las muestras a 120 voltios a 4 grados Celsius durante 1,5 horas o hasta que los estándares de peso molecular indiquen que las proteasas de interés están dentro de la capa de gel de resolución de péptidos. Después de esto, retire los geles del casete de plástico.
Lave los geles tres veces en tampón renaturalizante a temperatura ambiente con agitación suave, y cada lavado dura 10 minutos. Transfiera los geles a una solución tampón en desarrollo durante 15 minutos. Luego, reemplace la solución con tampón de revelado fresco e incube a 37 grados Celsius bajo agitación suave durante 24 horas. Después de esto, use un escáner / generador de imágenes de gel fluorescente con los filtros de excitación y emisión apropiados para obtener imágenes de los geles.