Entrega de genes basada en electroporación en el útero: una técnica para inyectar ADN plasmídico en células cerebelosas embrionarias de embriones murinos

Comience tomando una modelo de ratón hembra anestesiada embarazada colocada en posición supina. Prepara el ratón quitando el vello de la región abdominal. Hacer una incisión en la piel y las capas musculares subyacentes para exponer los cuernos uterinos, los sitios que albergan embriones viables.

Ahora, saque los cuernos uterinos de la cavidad abdominal. Tome un capilar de vidrio de punta afilada que contenga la solución de ADN plasmídico deseada. Localice el cerebro del embrión e inyecte la solución de ADN plasmídico a través de la pared del útero en el cuarto ventrículo. Esta posición es anterior al primordio cerebeloso, la ubicación deseada para la eventual entrega de ADN.

Después de la inyección, retraiga el capilar vacío. A continuación, para la electroporación del embrión inyectado de ADN, coloque los dos electrodos sobre la pared uterina de modo que el electrodo positivo cubra el primordio cerebeloso y el electrodo negativo cubra la región alrededor de las orejas.

Aplique pulsos eléctricos durante la duración deseada. Estos pulsos hacen que las células neuronales cerebelosas sean permeables, lo que permite que el ADN plasmídico ingrese a las células objetivo. Finalmente, vuelva a colocar los cuernos uterinos dentro de la cavidad abdominal en su posición natural. Sutura los cortes, transfiere el ratón a su jaula y deja que se recupere.

Comience cargando un capilar de vidrio de borosilicato en un extractor de micropipetas y tirando para crear una punta fina. Etiquete la punta capilar con tinta negra para una mejor visualización durante la inyección y dibuje una escala en el vidrio. Trabajando bajo un microscopio estereoscópico, use una regla y pinzas de aguja afiladas para recortar la punta a una longitud de aproximadamente 6 milímetros y crear un borde biselado afilado de un solo lado.

Filtre una solución madre Fast Green al 1% a través de un filtro de 0,22 micras para eliminar las partículas de tinte de la solución. Mezcle los plásmidos de ARN guía única en partes iguales con el plásmido reportero de luciferasa hasta una concentración final de al menos 1 microgramo por mililitro para cada plásmido.

Colorea la solución de plasma con Fast Green a una concentración final del 0,05%. Después de anestesiar a un ratón CD-1 preñado con isoflurano, coloque el ratón boca arriba sobre una almohadilla térmica y administre analgésico. Aplique ungüento para los ojos para prevenir la sequedad ocular durante la cirugía. Fije las extremidades con cinta adhesiva y esterilice el abdomen con un desinfectante.

Cubra el ratón con una gasa, dejando solo el área quirúrgica expuesta. Después de hacer una incisión en la piel de unos 2 centímetros de longitud, localiza la línea alba y utiliza unas tijeras de tejido de punta roma para hacer una segunda incisión ligeramente más pequeña a través del peritoneo. Humedezca la cavidad abdominal abierta con PBS estéril precalentado.

A continuación, use fórceps de anillo para extraer cuidadosamente los cuernos uterinos de la cavidad abdominal. Agarre la pared uterina en el espacio entre los sacos vitelinos de dos embriones vecinos y tire suavemente. Evite cualquier presión sobre el embrión mientras lo tira a través de la incisión. Una vez extraídos los cuernos uterinos, aspirar aproximadamente de 10 a 15 microlitros de solución plasmídica coloreada con el capilar de vidrio preparado. Evite las burbujas de aire durante este proceso.

Sostenga suavemente el embrión con fórceps de anillo y ubique el área del cuello. Penetre lentamente en el rombencéfalo dorsal con la punta del capilar de vidrio y muévase hacia el cuarto ventrículo. Inyecte aproximadamente 1 microlitro de la mezcla de plásmidos. Confirme que el ADN teñido no se ha filtrado del cerebro y es visible como una estructura en forma de diamante.

Aquí, es más importante llenar toda la región del cuarto ventrículo con una solución plásmida para administrar ADN también a la parte distal del primordio cerebeloso. Al mismo tiempo, asegúrese de no causar ningún sangrado durante ese proceso.

Coloque pinzas de platino equipadas con placas de electrodos de 5 milímetros de diámetro lateralmente sobre la cabeza del embrión con el polo negativo cubriendo la oreja y el polo positivo colocado en el primordio cerebeloso sobre la pared uterina y aplique pulsos cuadrados eléctricos.

Cuando todos los embriones hayan sido electroporados, vuelva a colocar con cuidado los cuernos uterinos en la cavidad abdominal y llénelos con PBS estéril. Deje que el cuerno uterino se deslice a una posición natural. Apague la anestesia y coloque al animal boca abajo en una nueva jaula para que se recupere.