Inducción de glioblastoma mediante transposición mediada por SB: una técnica para generar un nuevo modelo de ratón mediante la integración mediada por transposones de plásmido SB en el cerebro de ratón neonatal

Comience tomando un tubo que contenga una mezcla de plásmidos. El plásmido transposón de la bella durmiente o SB está diseñado para transportar un elemento transponible que comprende un oncogén inductor de glioblastoma derivado de humanos intercalado entre dos secuencias repetidas invertidas. Además, esta mezcla contiene un plásmido de transposasa SB que tiene un elemento expresor de la enzima transposasa.

Ahora, agregue un reactivo de transfección adecuado al tubo. Aspire la mezcla inyectable en una jeringa equipada con una microaguja. A continuación, asegure un cachorro de ratón anestesiado en posición prona sobre un marco estereotáxico. Visualice la región de la cabeza del cachorro para ubicar las suturas craneales. Coloque la microaguja por encima de las suturas craneales.

Inyecte la mezcla en el ventrículo lateral, una cavidad dentro del parénquima cerebral. Posteriormente, la solución se dispersa en el parénquima cerebral, donde las moléculas reactivas de transfección facilitan la entrada de plásmidos dentro de las células. Una vez dentro de la célula, el plásmido de transposasa expresa las moléculas de la enzima transposasa, que reconocen las secuencias repetidas invertidas y extirpan el elemento transposón.

El ADN del elemento transponible luego se reintegra en la región de repetición TA del ADN genómico del cachorro. La transposición genética da como resultado una transformación oncogénica de las células cerebrales, lo que lleva al desarrollo de glioblastoma en el cerebro del ratón.

De 3 a 4 semanas antes del experimento, instale una jaula de cría de ratones con un macho y una hembra. Incluye un iglú de plástico de colores para enriquecer el ambiente y aumentar las posibilidades de apareamiento. Retire al macho una vez que se haya confirmado un embarazo y, 18 días después del día de apareamiento, comience a monitorear a la hembra para el parto. Asegúrese de que haya una madre sustituta disponible en el momento del parto.

El primer día postnatal, realice las inyecciones intraventriculares. Prepare la solución de inyección alícuotas primero 20 microlitros de la mezcla de ADN que contiene los plásmidos transposones a una concentración final de 0,5 microgramos de ADN por microlitro. A continuación, agregue una alícuota de 20 microlitros de solución de PEI a la solución de ADN y déjelos incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos a una hora, después de lo cual la mezcla debe almacenarse en hielo.

Para la aguja de inyección, conecte una jeringa de 10 microlitros a una aguja hipodérmica de calibre 30 biselada a 12,5 grados. Luego, conecte la jeringa a una bomba con inyección automática. Pruebe la configuración con 10 microlitros de agua y asegúrese de vaciar la jeringa. Ahora, enfríe la etapa estereotáxica neonatal con una suspensión de hielo seco y alcohol. Cuando se enfríe entre 2 y 8 grados centígrados, proceda con las inyecciones.

Anestesia a un cachorro colocándolo en hielo durante 2 minutos. Mientras el cachorro está en hielo, cargue la jeringa con la solución de inyección. Una vez anestesiado, transfiera al cachorro al marco e inmovilice su cabeza entre las barras de los oídos cubiertas de gasa. Verifique que el lado dorsal del cráneo esté horizontal y paralelo a la superficie del marco. Además, las suturas craneales deben ser claramente visibles.

Si la cabeza del cachorro no está inmovilizada con la suficiente firmeza, se moverá durante la inyección, mientras que si se aprieta con demasiada firmeza entre las barras de los oídos del marco, la lambda no será visible y la presión dentro de la cabeza obligará a que la solución inyectada se filtre.

Con el cachorro agarrado firmemente por el marco, limpie la cabeza con etanol al 70%. Luego, baje la aguja y ajuste su posición para que entre en contacto con la lambda. A continuación, levante la aguja y muévala 0,8 milímetros lateralmente y 1,5 milímetros rostralmente. Luego, bájelo nuevamente hasta que forme un ligero hoyuelo en la piel. Registre las coordenadas de esta posición. Luego, baje la aguja 1,5 milímetros a través de la piel y el cráneo y hacia la corteza en el ventrículo lateral.

Allí, inyecte 0,75 microlitros durante 90 segundos y espere un minuto para que la solución se disperse. Mientras espera, se puede anestesiar al próximo cachorro que se inyectará. Después de la espera, levante lentamente la aguja. Luego, transfiera al cachorro a un lugar de recuperación debajo de una lámpara de calefacción. El tiempo desde la anestesia hasta el calentamiento debe ser inferior a 10 minutos; cuanto más rápido, mejor.

Controle su respiración y, si es necesario, frote suavemente las extremidades para estimular la respiración. Una vez que el cachorro esté caliente, tenga un color rosado y un aliento constante, devuélvalo a su madre.