Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Investigación sobre el cáncer
0 visualizaciones • 4:21 min. • July 8th, 2025
Las células granulares cerebelosas son el tipo de neuronas más abundante del cerebro. La capa granular externa, EGL, está compuesta únicamente por precursores celulares granulares, GCP, que se diferencian y migran hacia adentro para formar la capa granular interna, IGL.
Para visualizar el desarrollo de células granulares, prepare una cámara de electroporación uniendo un ánodo a la base de una placa de Petri. Agregue medio de cultivo para cubrir el electrodo. Ahora, coloque un inserto de cultivo en el electrodo cubierto con medio. Transfiera las rodajas de cerebelo del embrión de pollo al inserto de cultivo en orientación sagital.
El plano sagital permite identificar la capa diana-EGL frente a diferentes capas del cerebelo. Agregue una solución de colorante viscoso que contenga un ADN plasmídico GFP sobre EGL. El ADN plasmídico GFP codifica una proteína fluorescente verde que se distribuye homogéneamente dentro del citoplasma celular y permite la obtención de imágenes de células vivas.
A continuación, coloque un cátodo en el medio cerca de EGL pero no directamente sobre el tejido. Luego, aplique múltiples pulsos eléctricos a diferentes regiones de EGL. Los pulsos eléctricos inducen poros temporales en la membrana celular, lo que permite que las células absorban el ADN plasmídico. Posteriormente, el ADN plasmídico permite la expresión de GFP en células granulares.
Obtener imágenes de las rodajas cerebelosas bajo un microscopio de fluorescencia para observar la diferenciación celular granular y el patrón de migración en diferentes etapas del desarrollo celular.
Construya una cámara de electroporación fijando el ánodo de un electroporador a la base de una placa de Petri de 60 milímetros con cinta aislante. Agregue aproximadamente 1 mililitro de HBSS para cubrir el electrodo. A continuación, coloque un inserto de cultivo de 0,4 micrómetros encima del electrodo cubierto con HBSS.
Utilice una pipeta Pasteur de 3 mililitros con punta cortada para transferir las rodajas identificadas, hasta 5 por inserto al inserto de cultivo. Luego, separe las rodajas y déjelas reposar en el inserto de cultivo en una orientación sagital. Con una pipeta, retire el exceso de medio de las rodajas de cerebro. Deje que el inserto descanse sobre el electrodo para que haya contacto entre el inserto y el electrodo.
En esta configuración, el inserto de cultivo con las rodajas descansará sobre la superficie del medio, manteniendo el circuito pero permitiendo la orientación espacial del cátodo. Con una punta de pipeta P10, pipetee 5 microlitros de ADN diluido con un 20% de Fast Green sobre la superficie de una región específica de cada corte. La adición de Fast Green asegura que la solución de ADN sea lo suficientemente viscosa como para prohibir la amplia dispersión del ADN.
Luego, coloque el cátodo sobre el tejido objetivo deseado y electropore las muestras. Evite el contacto directo del cátodo con el tejido colocándolo lo más cerca posible del tejido sin tocarlo realmente. Repita la electroporación en múltiples regiones de la capa granular externa en cada corte cerebeloso individual según lo desee.
Cuando termine, transfiera el inserto de cultivo a una placa de Petri de 30 milímetros. A cada cultivo, agregue 1 mililitro de medio de cultivo precalentado debajo del inserto de cultivo. Asegúrese de que el inserto no flote sobre el medio. El inserto de cultivo debe estar en contacto con el medio, pero las rodajas no deben bañarse en él.