Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Investigación sobre el cáncer
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[INSERTE FIGURE1 AQUÍ]
Figura 1: Columna vertebral disecada y médula espinal liberada de un ratón neonatal de 3 días de edad. La flecha en (a) apunta hacia el extremo caudal de la columna vertebral, donde se inserta una aguja para liberar la médula espinal. Una médula espinal liberada (b) se muestra sumergida en PBS.
[INSERTE FIGURE2 AQUÍ]
Figura 2: Gradiente de densidad, con células añadidas después de la centrifugación.<
Para aislar las neuronas de la médula espinal, tome una columna vertebral de un ratón neonatal y colóquela en una placa de Petri. Enjuague la columna vertebral con un amortiguador salino para liberar la médula espinal. Transfiera la médula espinal a un medio neuronal frío para promover la supervivencia celular.
A continuación, pica la médula espinal y transfiere los fragmentos a un tubo que contenga medio neuronal fresco. Incube el tubo en un baño de agua agitador para aclimatación. Después de la incubación, retire el medio gastado y agregue el medio de digestión. Las enzimas digestivas escinden la matriz del tejido para aflojar las células.
Realice la trituración aspirando los fragmentos de tejido en la pipeta y vacíe rápidamente los componentes, liberando células individuales en suspensión. Luego, transfiera esta suspensión a un tubo que contenga medio de gradiente de densidad y centrífuga.
Después de la centrifugación, la capa superficial del tubo contiene restos de tejido. La primera capa incluye oligodendrocitos y astrocitos. La segunda y tercera capas comprenden neuronas, y la tercera capa tiene la mayor pureza. Por último, el gránulo contiene células microgliales.
Recoja la tercera capa en un tubo nuevo y agregue medio neuronal para diluir el medio de gradiente de densidad. Centrífuga para peletizar las neuronas. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en un medio neurobasal para preservar las neuronas para futuros experimentos.
Para comenzar este procedimiento, separe la cabeza del cuerpo de los cachorros de ratón sacrificados con unas tijeras. A continuación, estabilice la cola y los brazos en la mesa de procedimientos con el lado dorsal hacia arriba. Luego, corta la piel con las tijeras de iris curvas. Después de eso, corte la médula espinal de la región lumbar justo por encima de las caderas y luego corte ambos lados del tórax para separarlo del cuerpo.
Lave las muestras secuencialmente en tres placas de Petri de 10 centímetros que contengan 5 mililitros de PBS esterilizado durante 10 segundos cada una para eliminar el exceso de tejido. Posteriormente, inserte una aguja de calibre 22 y una jeringa llena de 5 mililitros de PBS esterilizado en el extremo caudal de la columna vertebral y enjuague cranealmente, permitiendo que el cordón salga a una cuarta placa de Petri.
Transfiera la médula espinal en un tubo de 15 mililitros con 5 mililitros de HABG en hielo. Evite aplastar la médula espinal y repita los procedimientos para el resto de los cachorros. Idealmente, este proceso no debería tomar más de 30 minutos para que un grupo de cachorros garantice un aislamiento neuronal saludable.
Para preparar el gradiente de densidad, prepare cada una de las cuatro capas en cuatro tubos de 15 mililitros. Luego, agregue 1 mililitro de cada capa en un nuevo tubo de 15 mililitros. Comience con la capa 1 en la parte inferior y agregue secuencialmente hasta llegar a la capa 4 en la parte superior. Evite alterar las capas mientras agrega y cualquier movimiento vigoroso que pueda causar la mezcla. A continuación, agregue el medio de digestión al tejido picado. Coloque la muestra en una coctelera al baño maría a 30 grados centígrados. Luego, retire el pañuelo del baño de agua y déjelo reposar durante unos minutos.
Para realizar la trituración, aspira el exceso de medio de digestión. Suspender el tejido en 2 mililitros de HABG. Con una pipeta de diámetro estrecho, triture 10 veces en 45 segundos y evite introducir aire, ya que disminuirá significativamente el rendimiento viable. La trituración es uno de los pasos más críticos del procedimiento. El tejido debe introducirse y vaciarse con cuidado de la pipeta pulida al fuego, evitando el exceso de vigor, que puede provocar la muerte neuronal, o ser demasiado suave, lo que dará lugar a un bajo rendimiento.
Después de eso, aspire los 2 mililitros superiores del sobrenadante y transfiéralo a un nuevo tubo de 15 mililitros etiquetado como "colección". Repita los procedimientos de recolección dos veces más para producir 6 mililitros de sobrenadante. A continuación, transfiera lentamente el contenido del tubo de recolección al tubo de gradiente preparado previamente, evitando la interrupción del gradiente.
Para purificar las neuronas, centrifugar el tubo de gradiente durante 15 minutos a 800 x g y 22 grados centígrados. Recoja las capas deseadas y transfiéralas en un nuevo tubo de 15 mililitros. Para el aislamiento de neuronas de mayor pureza, recolecte la capa 3. Para obtener más rendimiento con menos pureza, recoja las capas 2 a 3.
A continuación, diluya el gradiente de densidad agregando 5 mililitros de HABG a las capas recién recolectadas. Centrifugarlo a 200 x g durante 2 minutos a 22 grados centígrados. Después de 2 minutos, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 5 mililitros de HABG moviendo el gránulo. Posteriormente, centrifugar la muestra a 200 x g durante 2 minutos a 22 grados centígrados nuevamente. Luego, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 3 mililitros de medio neurobasal moviendo el gránulo.