Del ratón en el útero de electroporación: Transefection controlada Gene espacio-temporal

El objetivo general de este procedimiento es obtener una transfección génica eficiente en el sistema nervioso central de ratón embrionario en un punto temporal de desarrollo y una zona cerebral deseados. Esto se logra primero mediante la preparación de capilares de precisión y electrodos del tipo aguja para prevenir daños uterinos. El segundo paso del procedimiento consiste en aprender un método único de sujeción de embriones utilizando un cable de luz de fibra óptica para visualizar embriones pequeños y realizar la inyección dirigida de ADN.

El tercer paso del procedimiento consiste en realizar una electroforesis con electrodos del tipo varilla sobre la superficie uterina con el fin de transfectar ADN en las partes superficiales del cerebro; el paso final del procedimiento es realizar una electroforesis con electrodos del tipo aguja en estructuras más profundas del cerebro, como el tálamo e hipotálamo. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren la capa cortical, una transfección específica o una transfección eficiente en el tálamo. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la inyección regular en el espacio intermedio, radica en ofrecer una mayor visibilidad y control sobre el sitio de inyección de los embriones en el útero.

Utilizamos un cable similar a una fibra óptica, que permite visualizar embriones desde E 9.5 y agujas hipodérmicas para transmitir ADN plasmídico a partes más profundas del cerebro, como el tálamo y el hipotálamo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el desarrollo cerebral, tales como la diferenciación neuronal, el patrón del cerebro y la conectividad neural. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque es complicado moldear la aguja, la vía eléctrica y lograr la posición adecuada.

El útero y los embriones. La demostración visual de este método es fundamental para observar cómo fabricar electrodos de aguja precisos y cómo posicionar los embriones para la electroforesis libre. Dado que estas dos etapas son clave para obtener resultados exitosos. Para preparar los capilares, utilice un extractor de micropipetas siguiendo las instrucciones del fabricante.

En este procedimiento, utilizamos tubos capilares de vidrio de un milímetro sin fibra interna. Las puntas de las micropipetas estiradas deben medir entre 800 micrómetros y un milímetro desde la punta, con un diámetro externo menor a 60 micrómetros, utilizando un microscopio estereoscópico; luego, con pinzas, se debe ocluir la punta de la micropipeta hasta alcanzar un diámetro de entre 20 y 30 micrómetros. Mida cada micropipeta utilizando un micrómetro.

A continuación, prepare microelectrodos mediante enrollado. Enrolle un extremo de un alambre de tungsteno alrededor de un pasador chapado en oro. Utilice alambre de tungsteno para los electrodos negativos y alambre de platino para los electrodos positivos.

Sujete el alambre al pasador con param. Luego inserte el alambre en el vástago de plástico de un hisopo de algodón y envuelva ambos extremos con phim. Afine la punta del alambre con papel de lija fino hasta que alcance de 20 a 30 micrómetros en la punta y 60 micrómetros entre 800 micrómetros y un milímetro desde la punta. Nuevamente, verifique las dimensiones finales con un micrómetro.

A continuación, sumerja el alambre afilado en una gota de esmalte de uñas para aplicar una capa delgada sobre todo el alambre como aislante. Una vez que el esmalte se haya secado, use un bastoncillo de algodón con acetona para eliminarlo de los últimos 200 micrómetros de la punta del alambre. Los electrodos de platino se compran ya preparados y no requieren preparación.

En este procedimiento, utilizamos el electrodo de gen nepo CUY seis 10 P cuatro guion uno para purificar el ADN plasmídico mediante un método maxi prep o equivalente, eluir 100 microgramos de ADN en un tubo nuevo y añadir 10 microlitros de colorante azul rápido al 1%. Utilice TE para llevar el volumen hasta 100 microlitros, obteniendo una concentración final de un microgramo por microlitro de ADN plasmídico. Mezcle suavemente la solución mediante pipeteo, luego centrifugue la solución de ADN durante cinco minutos a 14.000 RPM a temperatura ambiente para eliminar impurezas y sales.

Transfiera el SNAT a un nuevo tubo. La solución de ADN puede mantenerse a temperatura ambiente en el tubo durante todo el procedimiento. A continuación, conecte una aguja estirada a un micromanipulador según las instrucciones del fabricante, y sumerja la punta de la aguja en la solución de ADN para llenarla.

Coloque cuidadosamente el micromanipulador a un lado y prepárese para la cirugía antes de la cirugía. Pese un ratón hembra preñado en los días embrionarios 9.5 a 15.5 para determinar su peso corporal.

Luego, intraperitoneal. Inyecte pentobarbital sódico de grado farmacéutico a 50 microgramos por gramo de peso corporal y espere cinco minutos. Las alternativas al pentobarbital sódico podrían incluir ketamina, xilacina, inyección o anestésicos gaseosos.

Tras la anestesia, use una hoja de afeitar y etanol al 50 % para afeitar el vello del abdomen. Prepare la piel con frotaciones alternadas de Betadine y alcohol al 70 %. Haga una incisión en la línea media abdominal con tijeras finas.

Extraiga cuidadosamente todos los cuernos uterinos sobre una gasa de algodón húmeda con solución salina tamponada con fosfatos al 1x o PBS, colocada alrededor de la herida. Mantenga el útero húmedo con PBS en todo momento. Utilizando un cable de fibra óptica flexible.

Coloque el cable bajo el cuerno uterino. Posicione el útero entre la luz de la fibra óptica y el pulgar, y presione suavemente para empujar al embrión hacia arriba, acercándolo a la pared uterina. Cuando el embrión esté posicionado con la cabeza a la izquierda y mirando hacia arriba, inserte cuidadosamente la capilar de vidrio en el ventrículo objetivo e inyecte aproximadamente un microlitro de solución de ADN para la electroforesis de la capa cortical cuatro en el día embrionario 13,5.

Coloque los electrodos de platino en forma de varilla en el exterior del útero y aplique pulsos de corriente en onda cuadrada cinco veces utilizando 38 voltios durante 50 milisegundos. Si utiliza electro poración micro para alcanzar el tálamo o el hipotálamo en el día embrionario 10.5, inserte el electrodo negativo fino de tungsteno en el ventrículo inyectado con ADN y el electrodo positivo de platino en el útero. Coloque la región diana entre los extremos de ambos electrodos y aplique pulsos de corriente en onda cuadrada sugeridos tres veces a siete voltios durante 100 milisegundos.

Una vez finalizada la electroforesis, devuelva el cuerno uterino a su ubicación original y agregue 500 microlitros de PBS. Suture la capa interna de la incisión con un hilo quirúrgico. Luego cierre la capa externa con un clip automático de nueve milímetros.

Coloque el ratón sobre una almohadilla térmica durante dos horas para permitir la recuperación tras la cirugía y la anestesia. Aquí se muestra la electroporación con platino de la región cortical aplicada en los días embrionarios 13,5, 14,5 y 15,5. Los cerebros se obtuvieron en estado posnatal.

Día seis. La capa de células corticales electroporadas es claramente diferente en cada experimento. Lo que sugiere que la electroporación dependiente del tiempo hace posible la ganancia específica de función y la pérdida de función en capas corticales.

Como se muestra aquí, la electroporación en un tejido profundo como el tálamo y el hipotálamo. El uso de electrodos de platino rígidos a menudo proporciona una baja eficiencia utilizando microelectrodos para la electrooperación. Estos tejidos profundos ofrecen una mejor eficiencia y viabilidad.

Inyectamos una solución de ADN plasmídico en el tercer ventrículo de embriones de ratón. En el día embrionario 11,5, aplicamos electroforesis con aguja restringida al tálamo; la mayor parte de los exones del tálamo proyectan hacia la corteza en el sexto día posnatal. Aquí mostramos la microelectroporación P-C-A-G-E-Y-F-P en el cefalón en desarrollo.

La región del tálamo se muestra mediante RORC, que marca todas las neuronas posmitóticas talámicas. Las proyecciones axónicas indicadas con flechas blancas hacia la capa cuatro de la corteza también pueden visualizarse mediante EYFP, que llena toda la neurona. La posición de la capa cuatro en la corteza también está marcada por el anticuerpo RORC.

Una vez iniciado el MA, esta técnica puede realizarse en 15 minutos por litro si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular la muestra con mucho cuidado para evitar cualquier daño tras seguir este procedimiento. Otros métodos, como incorporar un cromosoma específico al ADNm, pueden realizarse con el fin de comprender el mecanismo molecular de la especificación celular tras su desarrollo.

Esta técnica proporciona a los investigadores en el campo del desarrollo del sistema nervioso central una herramienta para explorar los mecanismos moleculares involucrados en el patrón, el crecimiento axonal y la formación de circuitos.