Knockdown de genes mediados por ARN de horquilla corta en iHSPCs in vitro: un sistema de expresión de shRNA basado en lentivirus que se entrega en iHSPCs para la eliminación de la expresión de genes específicos

Comience con un cultivo inmortalizado de células madre hematopoyéticas y progenitoras, iHSPC, en medios que contienen hormonas esteroides específicas y citoquinas hematopoyéticas, que regulan la proliferación celular en un estado indiferenciado. Agregue un polímero catiónico adecuado y vectores lentivirales.

Los virus recombinantes llevan secuencias codificantes para ARN de horquilla corta, ARNsh, dirigidos hacia un gen huésped específico y un gen marcador de resistencia a los antibióticos.

Centrifugar para sedimentar células y virus. Durante la incubación, los polímeros catiónicos neutralizan las cargas de la membrana celular, mejorando la unión viral. Después de la fusión de membranas, el material genético viral y las enzimas se liberan en el citoplasma celular. El genoma viral se transcribe de forma inversa, se mueve hacia el núcleo y se integra en el genoma del huésped.

Bajo la influencia de un promotor específico en la construcción, la construcción del gen shRNA que comprende una secuencia de coincidencia de ARNm diana, un segmento de bucle y otra secuencia complementaria a la primera, se transcribe formando shRNA con segmento de bucle de nucleótidos no apareados. Después de l