Edición del genoma CRISPR todo en uno: un método para el knock-in de genes basado en la reparación dirigida por homología en células cultivadas mediante el sistema CRISPR-Cas9
Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 5:12 min. • July 8th, 2025
Comience agregando plásmido CRISPR todo en uno a las células inmunitarias presentes en un tubo. Este plásmido contiene un gen Cas9 en combinación con el sgRNA o secuencia codificante de ARN de guía única, complementario a la secuencia diana en el genoma del huésped.
Agregue un plásmido donante linealizado que contenga un transgén intercalado entre brazos de homología o HA: las repeticiones de ADN necesarias para la recombinación homóloga. Realice electroporación, que utiliza corriente eléctrica para inyectar la mezcla de plásmidos en la célula. Una vez dentro, el sgRNA procesado forma un complejo con la nucleasa Cas9 expresada.
El sgRNA se une al sitio objetivo, lo que permite que la nucleasa Cas9 identifique la secuencia de reconocimiento específica conocida como motivo adyacente protoespaciador o PAM, y escinda el ADN del huésped cerca de él. Esto crea una ruptura de doble hebra de extremo romo donde la maquinaria celular reseca el ADN, generando voladizos de 3 '. La presencia de sitios flanqueantes de HA desencadena el mecanismo de reparación dirigido por homología donde el ADN cortado se une a la secuencia de HA, formando una estructura heterodúplex: el bucle D.
La síntesis de
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos