Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 5:12 min. • July 8th, 2025
Comience agregando plásmido CRISPR todo en uno a las células inmunitarias presentes en un tubo. Este plásmido contiene un gen Cas9 en combinación con el sgRNA o secuencia codificante de ARN de guía única, complementario a la secuencia diana en el genoma del huésped.
Agregue un plásmido donante linealizado que contenga un transgén intercalado entre brazos de homología o HA: las repeticiones de ADN necesarias para la recombinación homóloga. Realice electroporación, que utiliza corriente eléctrica para inyectar la mezcla de plásmidos en la célula. Una vez dentro, el sgRNA procesado forma un complejo con la nucleasa Cas9 expresada.
El sgRNA se une al sitio objetivo, lo que permite que la nucleasa Cas9 identifique la secuencia de reconocimiento específica conocida como motivo adyacente protoespaciador o PAM, y escinda el ADN del huésped cerca de él. Esto crea una ruptura de doble hebra de extremo romo donde la maquinaria celular reseca el ADN, generando voladizos de 3 '. La presencia de sitios flanqueantes de HA desencadena el mecanismo de reparación dirigido por homología donde el ADN cortado se une a la secuencia de HA, formando una estructura heterodúplex: el bucle D.
La síntesis de ADN continúa, formando una hebra complementaria a la secuencia transgénica hasta que se vuelve a unir a la hebra de ADN original. La parte superior del bucle D actúa como una plantilla para sintetizar la parte faltante del ADN, generando las uniones dobles de Holliday, estructuras donde interactúan cuatro hebras de ADN. Estas uniones se resuelven y los huecos se reparan, facilitando la inserción del gen diana.
Prepare una placa de 24 pocillos que contenga 500 microlitros de medio de crecimiento completo sin antibióticos en cada pocillo. Precaliente la placa en una incubadora humidificada de 37 grados al 5% de dióxido de carbono. Encienda el sistema de electroporación. Parámetros de electroporación de entrada para celdas JURKAT o RAW.
Prepare la mezcla de ADN celular para la electroporación. Recoger el cultivo de células JURKAT en un matraz de 25 centímetros cuadrados. Transfiera las células a un tubo de centrífuga de 50 ml. Luego, granular las células por centrifugación a 90 x g durante ocho minutos a temperatura ambiente.
En cuanto a los sobrenadantes, para el lavado, vuelva a suspender las células con DPBS de 5 ml. Luego, centrifugar la suspensión celular por centrifugación, utilizando la misma condición que el paso anterior. Retire el DPBS y vuelva a suspender el sedimento celular con 2 ml de DPBS. Utilizar 10 microlitros de suspensión celular y mezclar con un volumen igual de azul de tripano al 0,2%.
Para estimar el recuento de células, cargue la muestra en este portaobjetos de recuento. Inserte la diapositiva de conteo en el contador de celdas automatizado y vea la imagen de las celdas, luego obtenga un resultado de recuento de celdas. Calcule 2 millones de celdas para 5 repeticiones de electroporación, por experimento de knock-in.
Transfiera la cantidad requerida de celdas al tubo de centrífuga de 1,5 ml. Celdas de pellets por centrifugación. Para ahorrar tiempo, se puede preparar una mezcla de electroporación durante el paso de centrifugación. Agregue 2,5 microgramos de cada vector CRISPR-Cas9, 2,4 microgramos de vector de orientación linealizado y tampón R de resuspensión, hasta un volumen total de 55 microlitros, en un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 ml.
Agite suavemente y gire brevemente para mezclar bien. Deje la mezcla de electroporación a temperatura ambiente antes de usarla. Después de centrifugar, aspire el DPBS, luego centrifugue durante 30 segundos más. Elimine la mayor cantidad posible de sobrenadante. Vuelva a suspender las celdas agregando la mezcla de electroporación preparada. Pipetea hacia arriba y hacia abajo suavemente.
Electroporación: En cuanto a la mezcla de electroporación celular, utilizar una punta de nucleofección de 10 microlitros con pipeta.
Importante: Evite las burbujas de aire durante el pipeteo, ya que provocará un fallo de electroporación. Presiona "Iniciar".
Después de la electroporación, transfiera la muestra a un pocillo de placas de 24 pocillos con medio de crecimiento precalentado. Realice los mismos procedimientos de electroporación que los anteriores, en las 4 muestras replicadas restantes. Agite suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme de las células. Incube las células en una incubadora de 37 grados durante 48 a 72 horas antes de la clasificación de células FACS.