Silenciamiento génico basado en interferencias CRISPR: una técnica para la represión dirigida de la función génica en leptospira patógena

La interferencia CRISPR o CRISPRi, utiliza una variante desactivada de Cas9, dCas9, para el silenciamiento génico dirigido, que reprime la función génica.

Para realizar CRISPRi, use una construcción de vector lanzadera: un plásmido que contiene orígenes de replicación correspondientes a las bacterias E. coli y Leptospira, lo que facilita la propagación en ambas especies.

El vector también contiene una secuencia específica para el gen dCas9 y un ARN de guía única o sgRNA, para reconocer la secuencia diana.

Inicialmente, el vector lanzadera está presente dentro de la E. coli donante. Complemente el cultivo de E. coli del donante con el huésped Leptospira para facilitar la conjugación. La conjugación establece un contacto directo de célula a célula entre organismos, lo que facilita la captación del plásmido por Leptospira. Dentro de la célula, la construcción del plásmido produce secuencias de sgRNA y expresa proteínas dCas9.

El sgRNA contiene una región protoespaciadora que reconoce su región diana complementaria en el ADN de Leptospira, cerca del motivo adyacente al protoespaciador o PAM, una secuencia de reconocimiento corta en el ADN del huésped. Esto ayuda a dCas9 a formar un complejo con el sgRNA en el sitio objetivo aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción del gen.

dCas9 del complejo sgRNA-dCas9 no tiene la actividad catalítica para escindir las hebras de ADN, sino que actúa como una barrera física para el movimiento de la enzima ARN polimerasa formadora de ARNm, lo que eventualmente inhibe la transcripción de genes. Use Leptospira silenciada genéticamente para realizar más pruebas.

Para la conjugación, las células de Leptospira se cultivan a 29 o 37 grados Celsius en medios HAN. Un día antes de la conjugación, las células de E. coli del donante se cultivan en medios LB suplementados con ácido diaminopimélico - DAP y espectinomicina.

A continuación, en el día de la conjugación, cultive los cultivos saturados de E. coli en LB más DAP. Dentro de una campana de bioseguridad, ensamble el aparato de filtración colocando el filtro de membrana encima de la base de vidrio, seguido de un embudo de vidrio de 15 ml. Ambas piezas se mantienen unidas por la abrazadera de resorte. Luego, conecte el vidrio a una bomba de vacío. Agregue 5 ml de cultivos de Leptospira al embudo.

A continuación, agregue la cepa de E. coli β2163 que contiene el plásmido de interés. El volumen variará según la densidad óptica del cultivo. Nuestro objetivo es una proporción de células de 1:1. Gire la bomba de vacío. Ahora, los líquidos atravesarán la membrana y las células se concentrarán en la parte superior.

Tome el filtro y colóquelo en la placa EMJH más DAP, con el lado bacteriano hacia arriba. Incube las placas a 29 grados centígrados durante 24 horas. Luego, recupere los filtros de las placas y colóquelos en un tubo cónico de 50 ml.

Utilice 1 ml de medio HAN líquido para recuperar las células del filtro mediante pipeteo. Visualice las células recuperadas mediante microscopía de campo oscuro.

En esta etapa, se puede ver un número equivalente de E. coli y leptospiras. Se utilizan de 100 a 200 microlitros para propagar la bacteria en dos placas de HAN que contienen espectinomicina. En esta etapa, se omite DAP y E. coli no crecerá. Las placas se incuban a 37 grados Celsius y 3% de CO₂. Las colonias deben ser evidentes entre 8 y 10 días.