Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 3:27 min. • July 8th, 2025
El sistema tetraciclina-On o Tet-On es un sistema de expresión génica condicional que activa la expresión del gen de interés en presencia de tetraciclina o su análogo, la doxiciclina.
Comience con un ratón modificado genéticamente con un genoma modificado que contiene un gen que codifica la proteína activadora transcripcional controlada por tetraciclina inversa, o rtTA, impulsada por un promotor específico del hígado en las células hepáticas o los hepatocitos. Además, el ratón contiene un gen de interés bajo el control del operador de tetraciclina o secuencias de tetO ubicadas aguas arriba y fusionadas selectivamente a un promotor mínimo. El tetO y el promotor se denominan elemento sensible a la tetraciclina, o TRE.
El rtTA expresado, una proteína de fusión que comprende el represor tet, tetR y el dominio de transactivación de la proteína viral VP16, forma dímeros, que están inactivos y no pueden unirse a la secuencia tetO del TRE, lo que impide la activación de la expresión génica diana.
Prepare una solución que contenga doxiciclina y sacarosa. La adición de sacarosa aumenta la palatabilidad. Después del filtrado, proporcione la solución de doxiciclina-sacarosa como agua potable al ratón. La doxiciclina administrada se acumula en el hígado.
En los hepatocitos, la doxiciclina se une al rtTA, causando un cambio conformacional y una mayor afinidad por el sitio de unión al ADN tetO. El dominio de unión al ADN tetR de rtTA unido a doxiciclina se une a la secuencia tetO del elemento TRE. El dominio VP16 recluta además ARN polimerasa, lo que lleva a la transcripción, la formación de ARNm y la posterior expresión del gen diana reportero aguas abajo.
Para experimentos de menos de 10 días, administre continuamente doxiciclina a través del agua potable utilizando el siguiente protocolo. Primero, disuelva 5 gramos de sacarosa en 100 mililitros de agua del grifo y autoclave.
Luego, disuelva 100 miligramos de doxiciclina-hiclato en 5 mililitros de la solución de sacarosa en un tubo cónico de 15 mililitros. Luego, use una jeringa de 10 mililitros para filtrar estérilmente la solución a través de un filtro de 0.2 micrones, luego, agregue la solución de doxiciclina filtrada a los 95 mililitros restantes de solución de sacarosa y suministre la solución al ratón en lugar de beber agua. Verifique diariamente y reemplácela inmediatamente si la solución se vuelve turbia, ya que esto indica un crecimiento excesivo de bacterias.